本发明提供了FGFR3抗体,和包含这些抗体的组合物和使用这些抗体的方法。
1.一种分离的抗-FGFR3拮抗剂抗体,其中所述抗体包含:HVR-L1,其由序列RASQDVDTSLA(SEQxa0IDxa0NO:87)组成,HVR-L2,其由序列SASFLYS(SEQxa0IDxa0NO:88)组成,HVR-L3,其由序列QQSTGHPQT(SEQxa0IDxa0NO:89)组成,HVR-H1,其由序列GFTFTSTGIS(SEQxa0IDxa0NO:84)组成,HVR-H2,其由序列GRIYPTSGSTNYADSVKG(SEQxa0IDxa0NO:85)组成,和HVR-H3,其由序列ARTYGIYDLYVDYTEYVMDY(SEQxa0IDxa0NO:86)组成。
2.权利要求1所述的抗-FGFR3拮抗剂抗体,其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区由SEQxa0IDxa0NO:132组成且所述轻链可变区由SEQxa0IDxa0NO:133组成。
3.权利要求1所述的抗-FGFR3拮抗剂抗体,其中所述抗体包含构架序列并且所述构架序列的至少一部分是人共有构架序列。
4.权利要求3所述的抗-FGFR3拮抗剂抗体,其中所述构架序列的至少一部分是人κ亚组共有构架序列和/或重链人亚组III共有构架序列。
5.权利要求1所述的抗-FGFR3拮抗剂抗体,其中所述抗体是单克隆抗体。
6.权利要求1所述的抗-FGFR3拮抗剂抗体,其中所述抗体是嵌合抗体。
7.权利要求1所述的抗-FGFR3拮抗剂抗体,其中所述抗体是人源化抗体。
8.权利要求1所述的抗-FGFR3拮抗剂抗体,其中所述抗体是亲和力成熟抗体。
9.权利要求1所述的抗-FGFR3拮抗剂抗体,其中所述抗体是人抗体。
10.权利要求1所述的抗-FGFR3拮抗剂抗体,其中所述抗体是双特异性抗体。
11.权利要求1所述的抗-FGFR3拮抗剂抗体,其中所述抗体是抗体片段。
12.编码前述权利要求中任一项所述的抗体的多核苷酸。
13.包含权利要求12所述的多核苷酸的载体。
14.一种制备抗-FGFR3拮抗剂抗体的方法,所述方法包括培养包含编码权利要求1-11中任一项所述的抗体的多核苷酸的宿主细胞,从而表达所述多核苷酸。
15.权利要求14所述的方法,所述方法还包括从培养物中回收所述抗体。
16.一种药物制剂,所述药物制剂包含权利要求1-11中任一项所述的抗体和药用载体。
17.权利要求1-11中任一项所述的抗-FGFR3拮抗剂抗体在制备用于治疗癌症的药物中的应用,其中所述癌症与FGFR3激活和/或FGFR3过表达相关。
18.权利要求1-11中任一项所述的抗-FGFR3拮抗剂抗体在制备用于抑制与FGFR3激活和/或FGFR3过表达相关的细胞增殖和/或消除来自与FGFR3激活和/或FGFR3过表达相关的癌症的癌细胞的药物中的应用。
19.权利要求17或18所述的应用,其中所述癌症是实体瘤。
20.权利要求19所述的应用,其中所述实体瘤是膀胱癌或多发性骨髓瘤。
21.权利要求17或18所述的应用,其中所述药物还包括另外的治疗剂。
22.权利要求1-11中任一项所述的抗-FGFR3拮抗剂抗体在制备用于治疗与FGFR3激活和/或FGFR3过表达相关的骨骼病症的药物中的应用。
23.权利要求22所述的应用,其中所述骨骼病症选自由以下组成的组:软骨发育不全、软骨发育不良、侏儒症、致死性发育不全和颅缝早闭综合症。相关申请的交叉引用本申请要求于2009年3月25日提交的美国专利申请号61/163,222的优先权,该申请的内容通过引用合并于本文。发明领域本发明总体上涉及分子生物学领域。更具体地,本发明涉及抗-FGFR3抗体及其用途。发明背景成纤维细胞生长因子(FGFs)和它们的受体(FGFRs)在胚胎发育、组织内环境稳定和代谢过程中具有关键性的作用(1-3)。在人类中,存在22种FGFs(FGF1-14,FGF16-23)和4种具有酪氨酸激酶结构域的FGF受体(FGFR1-4)。FGFR由具有两个或三个免疫球蛋白样结构域(IgD1-3)的细胞外配体结合区,单次跨膜区和细胞质的分开的酪氨酸激酶结构域组成。FGFR1,2和3各自具有两个主要的选择性剪接同种型,称为IIIb和IIIc。这些同种型在后半个IgD3中有约50个氨基酸的差异,并且具有截然不同的组织分布和配体特异性。通常,IIIb同种型见于上皮细胞中,而IIIc在间充质细胞中表达。在与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparanxa0sulfateproteoglycans)协同结合FGF后,FGFR二聚化并且在特定的酪氨酸残基处磷酸化。这有助于募集关键性的衔接蛋白(adaptorxa0protein),诸如FGFR底物2α(FRS2α),导致多个信号传导级联的激活,包括促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)和PI3K-AKT途径(1,3,4)。因此,FGF和它们的同源受体以前后相关(context-dependent)的方式调节众多的细胞过程,包括增殖、分化、迁移和存活。异常激活的FGFRs已经被认为与特定的人恶性肿瘤有关(1,5)。特别地,t(4;14)(p16.3;q32)染色体易位发生在约15-20%的多发性骨髓瘤患者中,导致FGFR3的过度表达并且与较短的总存活时间相关(6-9)。FGFR3也与赋予培养中的骨髓瘤细胞系以化学抗性有关(10),这与t(4;14)+患者对常规化疗的临床反应差相一致(8)。突变活化的FGFR3的过度表达足以诱导造血干细胞和成纤维细胞(11-14,15)、转基因小鼠模型(16)、和鼠骨髓移植模型(16,17)中的癌性转化。因此,FGFR3已经被提议作为多发性骨髓瘤中的潜在治疗靶标。实际上,靶向FGFRs的几种小分子抑制剂,尽管对FGFR3没有选择性并且针对某些其他激酶具有交叉抑制活性,但已经证明针对培养中和小鼠模型中的FGFR3-阳性骨髓瘤细胞具有细胞毒性(18-22)。还已经记载了在大部分膀胱癌症中存在FGFR3过度表达(23,24)。此外,已经在60-70%的乳头状膀胱癌和16-20%的肌肉侵袭性膀胱癌中鉴定到FGFR3的体细胞激活突变(24,25)。在细胞培养实验中,RNA干扰(11,26)或FGFR3单链Fv抗体片段抑制膀胱癌细胞增殖(27)。近来的研究证明FGFR3抗体-毒素缀合物通过FGFR3-介导的毒素递送至肿瘤而减弱膀胱癌细胞系的异种移植物的生长(28)。然而,仍然不清楚FGFR3信号传导是否的确是膀胱肿瘤体内生长的致癌驱动力。此外,基于体内模型还没有明确在膀胱癌中靶向FGFR3的治疗可能性。涉及FGFR3和抗-FGFR3抗体的出版物包括美国专利公开号2005/0147612;Rauchenberger等,Jxa0BiolChem(生物化学杂志)278(40):38194-38205(2003);WO2006/048877;Martinez-Torrecuadrada等,(2008)Molxa0Cancerxa0Ther(分子癌症治疗)7(4):862-873;WO2007/144893;Trudel等.(2006)107(10):4039-4046;Martinez-Torrecuadrada等(2005)Clinxa0Cancerxa0Res(临床癌症研究)11(17):6280-6290;Gomez-Roman等(2005)Clinxa0Cancerxa0Res(临床癌症研究)11:459-465;Direnzo,R等(2007)Proceedingsxa0ofxa0AACRxa0Annualxa0Meeting(AACR年会进展),摘要No.2080;WO2010/002862。很明显持续存在着对具有临床属性的药剂的需求,所述药剂最适于开发为治疗剂。本文所述的发明满足此需求并且提供其他益处。本文引用的所有参考文献,包括专利申请和出版物的全部内容通过引用合并。发明概述本发明部分地基于多种FGFR3结合剂(诸如抗体,及其片段)的鉴定。FGFR3呈现了重要的和有利的治疗靶标,并且本发明基于所述试剂与FGFR3的结合提供了组合物和方法。本发明的FGFR3结合剂,如本文所述,提供了用于靶向与FGFR3信号传导途径的表达和/或活性相关的病理学状况的重要的治疗剂和诊断剂。因此,本发明提供了与FGFR3结合相关的方法、组合物、试剂盒和制品。本发明提供了与FGFR3结合的抗体。在一个方面,本发明的特征在于与FGFR3结合的分离抗体。在一些实施方案中,所述抗体结合FGFR3IIIb同种型和/或FGFR3IIIc同种型。在一些实施方案中,所述抗体结合突变的FGFR3(例如,FGFR3xa0IIIbxa0R248C,S249C,G372C,Y375C,K652E,中的一种或多种和/或FGFR3xa0IIIcxa0R248C,S249C,G370C,Y373C,K650E中的一种或多种)。在一些实施方案中,所述抗体结合单体的FGFR3(例如,单体的FGFR3IIIb和/或IIIc同种型)。在一些实施方案中,所述抗体促进单体FGFR3的形成,诸如通过稳定与二聚体FGFR3形式相关的单体FGFR3形式。在一个方面,本发明提供了分离的抗-FGFR3抗体,其中所述抗体的全长IgG形式以1x10^-7或更强的Kd结合人FGFR3。如本领域中众所周知的那样,配体与其受体的结合亲合力可以使用多种测定中的任一种来测定,并且可以按照多种定量值来表示。因此,在一个实施方案中,结合亲合力表示为Kd值并且反映固有的结合亲合力(例如,具有最小化的抗体亲抗原性效应(avidityxa0effect))。通常和优选地,结合亲合力在体外测量,无论是在无细胞的环境中还是在细胞相关的环境中测量。本领域中已知的许多测定中的任一种,包括本文所述的那些,可以用来获得结合亲合力测量值,包括,例如,Biacore,放射免疫测定(RIA),和ELISA。在一些实施方案中,所述抗体的全长IgG形式以1x10^-8或更强的Kd,以1x10^-9或更强的Kd,或以1x10^-10或更强的Kd结合人FGFR3。通常,本发明的抗-FGFR3抗体是拮抗剂抗体。因此,在一个方面,所述抗-FGFR3抗体抑制FGFR3活性(例如,FGFR3-IIIb和/或FGFR3-IIIc活性)。在一些实施方案中,抗-FGFR3抗体(通常以二价形式)不具有实质的FGFR3激动剂功能。在一些实施方案中,抗-FGFR3拮抗剂抗体(通常以二价形式)具有很少或没有FGFR3激动剂功能。在一个实施方案中,本发明的抗体(通常以二价形式)不显示超出本底水平的有统计学显著性的FGFR3激动剂活性水平。在一个方面,所述抗体与FGFR3的结合可以抑制所述受体与另一单位的所述受体的二聚作用,从而抑制所述受体的激活(至少部分由于缺乏受体二聚作用导致)。抑制可以是直接的或间接的。在一个方面,本发明提供了抗-FGFR3抗体,其不具有实质的凋亡活性(例如,不诱导细胞的凋亡,所述细胞例如,移行性细胞癌细胞或多发性骨髓瘤细胞,诸如包含FGFR3易位,诸如t(4;14)易位的多发性骨髓瘤细胞)。在一些实施方案中,抗-FGFR3抗体拥有很少或没有凋亡功能。在一些实施方案中,所述FGFR3抗体不显示超出本底水平的有统计学显著性的凋亡功能。在一个方面,本发明提供了抗-FGFR3抗体,其不诱导实质的FGFR3下调。在一些实施方案中,抗-FGFR3抗体诱导很少的或不诱导受体下调。在一些实施方案中,FGFR3抗体不诱导超出本底水平的有统计学显著性的受体下调。在一个方面,本发明提供了抗-FGFR3抗体,其拥有效应子功能。在一个实施方案中,效应子功能包括抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一个实施方案中,抗-FGFR3抗体(在一些实施方案中,裸抗-FGFR3抗体)能够杀死细胞,在一些实施方案中,杀死多发性骨髓瘤细胞(例如,包含易位,例如t(4;14)易位的多发性骨髓瘤细胞)。在一些实施方案中,抗-FGFR3抗体能够杀死每个细胞表达约10,000或更多个FGFR3分子(诸如每个细胞约11,000,约12,000,约13,000,约14,000,约15,000,约16,000,约17,000,约18,000或更多个FGFR3分子)的细胞。在其他实施方案中,所述细胞每个细胞表达约2000,约3000,约4000,约5000,约6000,约7000,约8000,或更多个FGFR3分子。在一个方面,本发明的抗-FGFR3抗体抑制组成型FGFR3活性。在一些实施方案中,组成型FGFR3活性是配体依赖性FGFR3组成型活性。在一些实施方案中,组成型FGFR3活性是配体不依赖性组成型FGFR3活性。在一个方面,抗-FGFR3抗体抑制包含对应于FGFR3-IIIb^R248C的突变的FGFR3。如本文所使用的术语“包含对应于FGFR3-IIIb^R248C的突变”理解为包涵FGFR3-IIIb^R248C和FGFR3-IIIc^R248C,以及另外的包含在对应于FGFR3-IIIbxa0R248的位置处的R至C突变的FGFR3形式。本领域普通技术人员理解如何比对FGFR3序列从而鉴定各个FGFR3序列之间的对应残基,例如,比对FGFR3-IIIc序列与FGFR3-IIIb序列以鉴定FGFR3中对应FGFR3-IIIb中的R248位置的位置。在一些实施方案中,所述抗-FGFR3抗体抑制FGFR3-IIIb^R248C和/或FGFR3-IIIc^R248C。在一个方面,抗-FGFR3抗体抑制包含对应于FGFR3-IIIb^K652E的突变的FGFR3。为了方便起见,术语“包含对应于FGFR3-IIIb^K652E的突变′′理解为包涵FGFR3-IIIb^K652E和FGFR3-IIIc^K650E,以及另外的包含在对应于FGFR3-IIIbxa0K652的位置处的K至E突变的FGFR3形式。本领域普通技术人员理解如何比对FGFR3序列从而鉴定各个FGFR3序列之间的对应残基,例如,比对FGFR3-IIIc序列与FGFR3-IIIb序列以鉴定FGFR3中的对应FGFR3-IIIb中的K652位置的位置。在一些实施方案中,所述抗-FGFR3抗体抑制FGFR3-IIIb^K652E和/或FGFR3-IIIc^K650E。在一个方面,抗-FGFR3抗体抑制包含对应于FGFR3-IIIb^S249C的突变的FGFR3。为了方便起见,术语“包含对应于FGFR3-IIIb^S249C的突变′′理解为包涵FGFR3-IIIbxa0^S249C和FGFR3-IIIcxa0^S249C,以及另外的包含在对应于FGFR3-IIIbxa0S249的位置处的S至C突变的FGFR3形式。在一些实施方案中,所述抗-FGFR3抗体抑制FGFR3-IIIb^S249C和/或FGFR3-IIIcxa0^S249C。在一个方面,抗-FGFR3抗体抑制包含对应于FGFR3-IIIb^G372C的突变的FGFR3。为了方便起见,术语“包含对应于FGFR3-IIIb^G372C的突变′′理解为包涵FGFR3-IIIbxa0^G372C和FGFR3-IIIcxa0^G370C,以及另外的包含在对应于FGFR3-IIIbxa0G372的位置处的G至C突变的FGFR3形式。在一些实施方案中,所述抗-FGFR3抗体抑制FGFR3-IIIb^G372C和/或FGFR3-IIIcxa0^G370C。在一个方面,抗-FGFR3抗体抑制包含对应于FGFR3-IIIb^Y375C的突变的FGFR3。为了方便起见,术语“包含对应于FGFR3-IIIb^Y375C的突变′′理解为包涵FGFR3-IIIb^Y375C和FGFR3-IIIc^Y373C,以及另外的包含在对应于FGFR3-IIIbxa0S249的位置处的S至C突变的FGFR3形式。在一些实施方案中,所述抗-FGFR3抗体抑制FGFR3-IIIb^Y375C和/或FGFR3-IIIc^Y373C。在一个方面,抗-FGFR3抗体抑制(a)FGFR3-IIIb^K652E和(b)FGFR3-IIIb^R248C,FGFR3-IIIb^Y375C,FGFR3-IIIb^S249C,和FGFR3IIIbxa0^G372C中的一种或多种。在一个方面,抗-FGFR3抗体抑制(a)FGFR3-IIIc^K650E和(b)FGFR3-IIIc^R248C,FGFR3-IIIc^Y373C,FGFR3-IIIc^S249C,和FGFR3IIIcxa0^G370C中的一种或多种。在一个方面,抗-FGFR3抗体抑制(a)FGFR3-IIIb^R248C和(b)FGFR3-IIIb^K652E,FGFR3-IIIb^Y375C,FGFR3-IIIb^S249C,和FGFR3-IIIb^G372C中的一种或多种。在一个方面,抗-FGFR3抗体抑制(a)FGFR3-IIIc^R248C和(b)FGFR3-IIIc^K650E,FGFR3-IIIc^Y373C,FGFR3-IIIc^S249C,和FGFR3-IIIc^G370C中的一种或多种。在一个方面,抗-FGFR3抗体抑制(a)FGFR3-IIIb^G372C和(b)FGFR3-IIIb^K652E,FGFR3-IIIb^Y375C,FGFR3-IIIb^S249C,和FGFR3-IIIb^R248C中的一种或多种。在一个方面,抗-FGFR3抗体抑制(a)FGFR3-IIIc^G370C和(b)FGFR3-IIIc^K650E,FGFR3-IIIc^Y373C,FGFR3-IIIc^S249C,和FGFR3-IIIc^R248C中的一种或多种。在一个方面,抗-FGFR3抗体抑制FGFR3-IIIb^R248C,FGFR3-IIIb^K652E,FGFR3-IIIb^Y375C,FGFR3-IIIbxa0^S249C,和FGFR3-IIIbxa0^G372C。在一个方面,抗-FGFR3抗体抑制FGFR3-IIIc^R248C,FGFR3-IIIc^K650E,FGFR3-IIIc^Y373C,FGFR3-IIIcxa0^S249C,和FGFR3-IIIcxa0^G370C。在一个方面,本发明提供了分离的抗-FGFR3抗体,其包含:(a)至少一个、两个、三个、四个或五个高变区(HVR)序列,所述高变区序列选自:(i)HVR-L1,其包含序列A1-A11,其中A1-A11是RASQDVDTSLA(SEQxa0IDxa0NO:87),(ii)HVR-L2,其包含序列B1-B7,其中B1-B7是SASFLYS(SEQxa0IDNO:88),(iii)HVR-L3,其包含序列C1-C9,其中C1-C9是QQSTGHPQT(SEQxa0IDxa0NO:89),(iv)HVR-H1,其包含序列D1-D10,其中D1-D10是GFTFTSTGIS(SEQxa0IDxa0NO:84),(v)HVR-H2,其包含序列E1-E18,其中E1-E18是GRIYPTSGSTNYADSVKG(SEQxa0IDxa0NO:85),和(vi)HVR-H3,其包含序列F1-F20,其中F1-F20是ARTYGIYDLYVDYTEYVMDY(SEQxa0IDxa0NO:86);和(b)至少一个变体HVR,其中所述变体HVR序列包含SEQxa0IDNOS:1-18,48-131和140-145中所示的序列的至少一个残基(至少两个残基,至少三个或更多个残基)的修饰。所述修饰合意的是置换、插入或缺失。在一些实施方案中,HVR-L1变体包含下列位置的任意组合中的1-6个(1,2,3,4,5,或6个)置换:A5(V或D),A6(V或I),A7(D,E或S),A8(T或I),A9(A或S)和A10(V或L)。在一些实施方案中,HVR-L2变体包含下列位置的任意组合中的1-2个(1或2个)置换:B1(S或G),B4(F或S或T)和B6(A或Y)。在一些实施方案中,HVR-L3变体包含下列位置的任意组合中的1-6个(1,2,3,4,5,或6个)置换:C3(G或S或T),C4(T或Y或A),C5(G或S或T或A),C6(A或H或D或T或N),C7(Q或P或S),和C8(S或Y或L或P或Q)。在一些实施方案中,HVR-H1变体包含下列位置的任意组合中的1-3个(1,2,或3个)置换:D3(S或T),D5(W或Y或S或T),D6(S或G或T)。在一些实施方案中,HVR-H2变体包含下列位置的任意组合中的1-6个(1,2,3,4,5,或6)置换:E2(R或S),E6(Y或A或L或S或T),E7(A或Q或D或G或Y或S或N或F),E8(A或D或G),E9(T或S),E10(K或F或T或S),E11(Y或H或N或I)。在一个方面,本发明提供了分离的抗-FGFR3抗体,其包含:(a)至少一个、两个、三个、四个或五个高变区(HVR)序列,所述高变区序列选自:(i)HVR-L1,其包含序列RASQX₁X₂X₃X₄X₅X₆A,其中X₁是V或D,X₂是V或I,X₃是D,E或S,X₄是T或I,X₅是A或S,和X₆是V或L(SEQIDxa0NO:146),(ii)HVR-L2,其包含序列X₁ASFLX₂S,其中X₁是S或G且X₂是A或Y(SEQxa0IDxa0NO:147),(iii)HVR-L3,其包含序列QQX₁X₂X₃X₄X₅X₆T,其中X₁是G,S或T,X₂是T,Y或A,X₃是G,S,T,或A,X₄是A,H,D,T,或N,X₅是Q,P或S,X₆是S,Y,L,P或Q(SEQxa0IDxa0NO:148),(iv)HVR-H1,其包含序列GFX₁FX₂X₃TGIS,其中X₁是S或T,X₂是W,Y,S或T,X₃是S,G,或T(SEQxa0IDxa0NO:149),(v)HVR-H2,其包含序列GRIYPX₁X₂X₃X₄X₅X₆YADSVKG,其中X₁是Y,A,L,S,或T,X₂是A,Q,D,G,Y,S,N或F,X₃是A,D,或G,X₄是T或S,X₅是K,F,T,或S,X₆是Y,H,N或I(SEQxa0IDxa0NO:150),和(vi)HVR-H3,其包含序列ARTYGIYDLYVDYTEYVMDY(SEQxa0IDNO:151)。在一些实施方案中,HVR-L1包含序列RASQX₁VX₂X₃X₄VA,其中X₁是V或D,X₂是D,E或S,X₃是T或I,X₄是A或S(SEQxa0IDxa0NO:152)。在一些实施方案中,HVR-L3包含序列QQX₁X₂X₃X₄X₅X₆T,其中X₁是S,G,或T,X₂是Y,T,或A,X₃是T或G,X₄是T,H或N,X₅是P或S,X₆是P,Q,Y,或L(SEQxa0IDxa0NO:153)。在一些实施方案中,HVR-H2包含序列GRIYPX₁X₂GSTX₃YADSVKG,其中X₁是T或L,X₂是N,Y,S,G,A,或Q;X₃是N或H(SEQxa0IDxa0NO:154)。在另一个方面,本发明的特征在于分离的抗-FGFR3抗体,所述分离的抗-FGFR3抗体包含一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR,其中各个HVR包含选自下列的序列,由选自下列的序列组成,或基本上由选自下列的序列组成:SEQxa0IDxa0NOS:1-18,48-131和140-145,并且其中SEQIDxa0NO:1,7,13,48,54,60,66,72,78,84,90,96,102,108,114,120,126或143对应于HVR-H1,SEQxa0IDxa0NO:2,8,14,49,55,61,67,73,79,85,91,97,103,109,115,121,127或144对应于HVR-H2,SEQxa0IDxa0NO:3,9,15,50,56,62,68,74,80,86,92,98,104,110,116,122,128或145对应于HVR-H3,SEQxa0IDxa0NO:4,10,16,51,57,63,69,75,81,87,93,99,105,111,117,123,129或140对应于HVR-L1,SEQxa0IDxa0NO:5,11,17,52,58,64,70,76,82,88,94,100,106,112,118,124,130或141对应于HVR-L2,且SEQxa0IDxa0NO:6,12,18,53,59,65,71,77,83,89,95,101,107,113,119,125,131或142对应于HVR-L3。在一个方面,本发明提供包含HVR-H1的抗-FGFR3抗体,所述HVR-H1包含SEQxa0IDxa0NO:1,7,13,48,54,60,66,72,78,84,90,96,102,108,114,120,126或143的序列。在一个方面,本发明提供包含HVR-H2的抗-FGFR3抗体,所述HVR-H2包含SEQxa0IDxa0NO:2,8,14,49,55,61,67,73,79,85,91,97,103,109,115,121,127或144的序列。在一个方面,本发明提供包含HVR-H3的抗-FGFR3抗体,所述HVR-H3包含SEQxa0IDxa0NO:3,9,15,50,56,62,68,74,80,86,92,98,104,110,116,122,128或145的序列。在一个方面,本发明提供包含HVR-L1区的抗-FGFR3抗体,所述HVR-L1区包含SEQxa0IDxa0NO:4,10,16,51,57,63,69,75,81,87,93,99,105,111,117,123,129或140的序列。在一个方面,本发明提供包含HVR-L2区的抗-FGFR3抗体,所述HVR-L2区包含SEQxa0IDxa0NO:5,11,17,52,58,64,70,76,82,88,94,100,106,112,118,124,130或141的序列。在一个方面,本发明提供包含HVR-L3区的抗-FGFR3抗体,所述HVR-L3区包含SEQxa0IDxa0NO:6,12,18,53,59,65,71,77,83,89,95,101,107,113,119,125,131或142的序列。在一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,所述重链可变区包含HVR-H1,HVR-H2,HVR-H3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:1,2,3,所述轻链可变区包含HVR-L1,HVR-L2,和HVR-L3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:4,5,6。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,所述重链可变区包含HVR-H1,HVR-H2,HVR-H3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:7,8,9,所述轻链可变区包含HVR-L1,HVR-L2,和HVR-L3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:10,11,12。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,所述重链可变区包含HVR-H1,HVR-H2,HVR-H3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:13,14,15,所述轻链可变区包含HVR-L1,HVR-L2,和HVR-L3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:16,17,18。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,所述重链可变区包含HVR-H1,HVR-H2,HVR-H3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:48,49,50,所述轻链可变区包含HVR-L1,HVR-L2,和HVR-L3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:51,52,53。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,所述重链可变区包含HVR-H1,HVR-H2,HVR-H3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:54,55,56,所述轻链可变区包含HVR-L1,HVR-L2,和HVR-L3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:57,58,59。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,所述重链可变区包含HVR-H1,HVR-H2,HVR-H3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:60,61,62,63,所述轻链可变区包含HVR-L1,HVR-L2,和HVR-L3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:63,64,65。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,所述重链可变区包含HVR-H1,HVR-H2,HVR-H3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:66,67,68,所述轻链可变区包含HVR-L1,HVR-L2,和HVR-L3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:69,70,71。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,所述重链可变区包含HVR-H1,HVR-H2,HVR-H3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:72,73,74,所述轻链可变区包含HVR-L1,HVR-L2,和HVR-L3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:75,76,77。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,所述重链可变区包含HVR-H1,HVR-H2,HVR-H3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:78,7980,所述轻链可变区包含HVR-L1,HVR-L2,和HVR-L3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:81,82,83。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,所述重链可变区包含HVR-H1,HVR-H2,HVR-H3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:84,85,86,所述轻链可变区包含HVR-L1,HVR-L2,和HVR-L3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:87,88,89。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,所述重链可变区包含HVR-H1,HVR-H2,HVR-H3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:90,91,92,所述轻链可变区包含HVR-L1,HVR-L2,和HVR-L3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:93,94,95。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,所述重链可变区包含HVR-H1,HVR-H2,HVR-H3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:96,97,98,所述轻链可变区包含HVR-L1,HVR-L2,和HVR-L3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:99,100,101。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,所述重链可变区包含HVR-H1,HVR-H2,HVR-H3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:102,103,104,所述轻链可变区包含HVR-L1,HVR-L2,和HVR-L3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:105,106,107。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,所述重链可变区包含HVR-H1,HVR-H2,HVR-H3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:108,109,110,所述轻链可变区包含HVR-L1,HVR-L2,和HVR-L3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:111,112,113。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,所述重链可变区包含HVR-H1,HVR-H2,HVR-H3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:114,115,116,所述轻链可变区包含HVR-L1,HVR-L2,和HVR-L3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:117,118,119。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,所述重链可变区包含HVR-H1,HVR-H2,HVR-H3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:120,121,122,所述轻链可变区包含HVR-L1,HVR-L2,和HVR-L3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:123,124,125。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,所述重链可变区包含HVR-H1,HVR-H2,HVR-H3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:126,127,128,所述轻链可变区包含HVR-L1,HVR-L2,和HVR-L3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:129,130,131。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,所述重链可变区包含HVR-H1,HVR-H2,HVR-H3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:140,141,142,所述轻链可变区包含HVR-L1,HVR-L2,和HVR-L3,其中各个按顺序地包含SEQxa0IDxa0NO:143,144,145。SEQxa0IDxa0NOs:1-18,48-131和140-145的氨基酸序列关于如图1中所示的单个HVR(即,H1,H2或H3)进行编号,所述编号与如下所述的Kabat编号系统一致。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含SEQxa0IDxa0NO:132。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含轻链可变区和重链可变区,所述轻链可变区包含SEQxa0IDxa0NO:133。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含SEQxa0IDxa0NO:132,所述轻链可变区包含SEQxa0IDxa0NO:133。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含SEQxa0IDxa0NO:134。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含轻链可变区和重链可变区,所述轻链可变区包含SEQxa0IDxa0NO:135。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含轻链可变区和重链可变区,所述轻链可变区包含SEQxa0IDxa0NO:139。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含SEQxa0IDxa0NO:134,所述轻链可变区包含SEQxa0IDxa0NO:135。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含SEQxa0IDxa0NO:136。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含轻链可变区和重链可变区,所述轻链可变区包含SEQxa0IDxa0NO:137。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含SEQxa0IDxa0NO:136,所述轻链可变区包含SEQxa0IDxa0NO:137。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含SEQxa0IDxa0NO:138。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含轻链可变区和重链可变区,所述轻链可变区包含SEQxa0IDxa0NO:139。在另一个方面,抗-FGFR3抗体包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含SEQxa0IDxa0NO:138,所述轻链可变区包含SEQxa0IDxa0NO:139。在一个方面,本发明提供抗-FGFR3抗体,所述抗-FGFR3抗体包含:至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列,所述高变区序列选自由下列各项组成的组:(a)HVR-L1,其包含序列SASSSVSYMH(SEQxa0IDxa0NO:155),SASSSVSYMH(SEQxa0IDxa0NO:156)或LASQTIGTWLA(SEQxa0IDxa0NO:157),(b)HVR-L2,其包含序列TWIYDTSILAS(SEQxa0IDxa0NO:158),RWIYDTSKLAS(SEQxa0IDxa0NO:159),或LLIYAATSLAD(SEQxa0IDxa0NO:160),(c)HVR-L3,其包含序列QQWTSNPLT(SEQxa0IDxa0NO:161),QQWSSYPPT(SEQxa0IDxa0NO:162),或QQLYSPPWT(SEQxa0IDxa0NO:163),(d)HVR-H1,其包含序列GYSFTDYNMY(SEQxa0IDxa0NO:164),GYVFTHYNMY(SEQxa0IDxa0NO:165),或GYAFTSYNMY(SEQxa0IDxa0NO:166),(e)HVR-H2,其包含序列WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQxa0IDNO:167),WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQxa0IDxa0NO:168),或WIGYIDPYIGGTSYNQKFKG(SEQxa0IDxa0NO:169),和(f)HVR-H3包含序列ASPNYYDSSPFAY(SEQxa0IDxa0NO:170),ARGQGPDFDV(SEQxa0IDxa0NO:171),或ARWGDYDVGAMDY(SEQxa0IDNO:172)。在一个方面,本发明提供抗-FGFR3抗体,其包含:至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列,所述高变区序列选自由下列各项组成的组:(a)HVR-L1,其包含序列SASSSVSYMH(SEQxa0IDxa0NO:155),(b)HVR-L2,其包含序列TWIYDTSILAS(SEQxa0IDxa0NO:158),(c)HVR-L3,其包含序列QQWTSNPLT(SEQxa0IDxa0NO:161),(d)HVR-H1,其包含序列GYSFTDYNMY(SEQxa0IDxa0NO:164),(e)HVR-H2,其包含序列WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQxa0IDNO:167),和(f)HVR-H3,其包含序列ASPNYYDSSPFAY(SEQxa0IDxa0NO:170)。在一个方面,本发明提供抗-FGFR3抗体,其包含:至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列,所述高变区序列选自由下列各项组成的组:(a)HVR-L1,其包含序列SASSSVSYMH(SEQxa0IDxa0NO:156),(b)HVR-L2,其包含序列RWIYDTSKLAS(SEQxa0IDxa0NO:159),(c)HVR-L3,其包含序列QQWSSYPPT(SEQxa0IDxa0NO:162),(d)HVR-H1,其包含序列GYVFTHYNMY(SEQxa0IDxa0NO:165),(e)HVR-H2,其包含序列WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQxa0IDNO:168),和(f)HVR-H3,其包含序列ARGQGPDFDV(SEQxa0IDxa0NO:171).在一个方面,本发明提供抗-FGFR3抗体,其包含:至少一个、两个、三个、四个、五个或六个高变区(HVR)序列,所述高变区序列选自由下列各项组成的组:(a)HVR-L1,其包含序列LASQTIGTWLA(SEQxa0IDxa0NO:157),(b)HVR-L2,其包含序列LLIYAATSLAD(SEQxa0IDxa0NO:160),(c)HVR-L3,其包含序列QQLYSPPWT(SEQxa0IDxa0NO:163),(d)HVR-H1,其包含序列GYAFTSYNMY(SEQxa0IDxa0NO:166),(e)HVR-H2,其包含序列WIGYIDPYIGGTSYNQKFKG(SEQxa0IDNO:169),和(f)HVR-H3,其包含序列ARWGDYDVGAMDY(SEQxa0IDxa0NO:172)。在一个方面,本发明提供抗-FGFR3抗体,所述抗-FGFR3抗体包含:(a)轻链,所述轻链包含:(i)HVR-L1,其包含序列SASSSVSYMH(SEQxa0IDNO:155);(ii)HVR-L2,其包含序列TWIYDTSILAS(SEQxa0IDxa0NO:158);和(iii)HVR-L3,其包含序列QQWTSNPLT(SEQxa0IDxa0NO:161);和/或(b)重链,所述重链包含:(i)HVR-H1,其包含序列GYSFTDYNMY(SEQxa0IDNO:164);(ii)HVR-H2,其包含序列WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQIDxa0NO:167);和(iii)HVR-H3,其包含序列ASPNYYDSSPFAY(SEQxa0IDNO:170)。在一个方面,本发明提供抗-FGFR3抗体,所述抗-FGFR3抗体包含:(a)轻链,其包含:(i)HVR-L1,其包含序列SASSSVSYMH(SEQxa0IDNO:156);(ii)HVR-L2,其包含序列RWIYDTSKLAS(SEQxa0IDxa0NO:159);和(iii)HVR-L3,其包含序列QQWSSYPPT(SEQxa0IDxa0NO:162);和/或(b)重链,其包含:(i)HVR-H1包含序列GYVFTHYNMY(SEQxa0IDxa0NO:165);(ii)HVR-H2,其包含序列WIGYIEPYNGGTSYNQKFKG(SEQxa0IDxa0NO:168);和(iii)HVR-H3,其包含序列ARGQGPDFDV(SEQxa0IDxa0NO:171)。在一个方面,本发明提供抗-FGFR3抗体,所述抗-FGFR3抗体包含:(a)轻链,其包含:(i)HVR-L1,其包含序列LASQTIGTWLA(SEQxa0IDNO:157);(ii)HVR-L2,其包含序列LLIYAATSLAD(SEQxa0IDxa0NO:160);和(iii)HVR-L3,其包含序列QQLYSPPWT(SEQxa0IDxa0NO:163);和/或(b)重链,其包含:(i)HVR-H1,其包含序列GYAFTSYNMY(SEQxa0IDxa0NO:166);(ii)HVR-H2,其包含序列WIGYIDPYIGGTSYNQKFKG(SEQxa0IDxa0NO:169);和(iii)HVR-H3,其包含序列ARWGDYDVGAMDY(SEQxa0IDxa0NO:172)。本发明的抗体的一些实施方案包含如下面SEQxa0IDxa0NO:173中所示的人源化4D5抗体(huMAb4D5-8)(ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="363"/>Genentech,Inc.,Southxa0SanFrancisco,CA,USA)(也在美国专利号6,407,213和Lee等.,J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)(2004),340(5):1073-1093中提及)的轻链可变结构域。Ixa0Aspxa0Ilexa0Glnxa0Metxa0Thrxa0Glnxa0Serxa0Proxa0Serxa0Serxa0Leuxa0Serxa0Alaxa0Serxa0Valxa0GlyAspxa0Argxa0Valxa0Thrxa0Ilexa0Thrxa0Cysxa0Argxa0Alaxa0Serxa0Glnxa0Aspxa0Valntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="105"/>Thrxa0AlaValxa0Alaxa0Trpxa0Tyrxa0Glnxa0Glnxa0Lysxa0Proxa0Glyxa0Lysxa0Alaxa0Proxa0Lysxa0Leuxa0Leuxa0IleTyrxa0Serxa0Alaxa0Serxa0Phexa0Leuxa0Tyrxa0Serxa0Glyxa0Valxa0Proxa0Serxa0Argxa0Phexa0Serxa0GlySerntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="92"/>Serxa0Glyxa0Thrxa0Aspxa0Phexa0Thrxa0Leuxa0Thrxa0Ilexa0Serxa0Serxa0Leuxa0Glnxa0Proxa0GluAspxa0Phexa0Alaxa0Thrxa0Tyrxa0Tyrxa0Cysxa0Glnxa0Glnntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="100"/>Tyrxa0Thrxa0Thrxa0Proxa0Proxa0ThrPhexa0Glyxa0Glnxa0Glyxa0Thrxa0Lysxa0Valxa0Gluxa0Ilexa0Lysxa0107(SEQxa0IDxa0NO:173)(HVR残基被下划线)在一个实施方案中,huMAb4D5-8轻链可变结构域序列在位置30,66,和91(分别如上面以粗体/斜体所示的Asn,Arg,和His)中的一个或多个处被修饰。在具体的实施方案中,修饰的huMAb4D5-8序列包含位置30中的Ser,位置66中的Gly,和/或位置91中的Ser。因此,在一个实施方案中,本发明的抗体包含轻链可变结构域,所述轻链可变结构域包含下面SEQxa0IDxa0NO:174中所示的序列:Ixa0Aspxa0Ilexa0Glnxa0Metxa0Thrxa0Glnxa0Serxa0Proxa0Serxa0Serxa0Leuxa0Serxa0Alaxa0Serxa0Valxa0GlyAspxa0Argxa0Valxa0Thrxa0Ilexa0Thrxa0Cysxa0Argxa0Alaxa0Serxa0Glnxa0Aspxa0Valntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="101"/>Thrxa0AlaValxa0Alaxa0Trpxa0Tyrxa0Glnxa0Glnxa0Lysxa0Proxa0Glyxa0Lysxa0Alaxa0Proxa0Lysxa0Leuxa0Leuxa0IleTyrxa0Serxa0Alaxa0Serxa0Phexa0Leuxa0Tyrxa0Serxa0Glyxa0Valxa0Proxa0Serxa0Argxa0Phexa0Serxa0Glyxa0Serntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="81"/>Serxa0Glyxa0Thrxa0Aspxa0Phexa0Thrxa0Leuxa0Thrxa0Ilexa0Serxa0Serxa0Leuxa0Glnxa0Proxa0GluAspxa0Phexa0Alaxa0Thrxa0Tyrxa0Tyrxa0Cysxa0Glnxa0Glnntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="91"/>Tyrxa0Thrxa0Thrxa0Proxa0Proxa0ThrPhexa0Glyxa0Glnxa0Glyxa0Thrxa0Lysxa0Valxa0Gluxa0Ilexa0Lysxa0107(SEQxa0IDxa0NO:174)(HVR残基被下划线)关于huMAb4D5-8的置换残基以粗体/斜体指示。本发明的抗体可以包含任何合适的构架可变结构域序列,条件是基本上保留与FGFR3的结合活性。例如,在一些实施方案中,本发明的抗体包含人亚组III重链构架共有序列。在这些抗体的一个实施方案中,构架共有序列包含位置71,73,和/或78处的置换。在这些抗体的一些实施方案中,位置71是A,73是T和/或78是A。在一个实施方案中,这些抗体包含huMAb4D5-8(ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="363"/>Genentech,Inc.,Southxa0Sanxa0Francisco,CA,USA)(也在美国专利号6,407,213和5,821,337,和Lee等.,J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)(2004),340(5):1073-1093中提及)的重链可变结构域构架序列。在一个实施方案中,这些抗体还包含人κI轻链构架共有序列。在具体的实施方案中,这些抗体包含如美国专利号6,407,213和5,821,337中所述的huMAb4D5-8的轻链HVR序列。在一个实施方案中,这些抗体包含huMAb4D5-8(ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="363"/>Genentech,Inc.,Southxa0Sanxa0Francisco,CA,USA)(也在美国专利号6,407,213和5,821,337,和Lee等.,J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)(2004),340(5):1073-1093中提及)的轻链可变结构域序列。在一个实施方案中,本发明的抗体包含重链可变结构域,其中构架序列包含SEQxa0IDxa0NOS:19和203-205,20和206-208,21和209-211,22和212-214,23和215-217,24和218-220,25和221-223,26和224-226,27和227-229,28和230-232,29和233-235,30和236-238,31和239-241,32和242-244,33和245-247,34和248-250,35和251-253,36和254-256,和/或37和257-259的序列,并且HVRxa0H1,H2,和H3序列分别是SEQxa0IDNOS:13,14和/或15。在另一个实施方案中,所述构架序列包含SEQxa0IDNOS:19和203-205,20和206-208,21和209-211,22和212-214,23和215-217,24和218-220,25和221-223,26和224-226,27和227-229,28和230-232,29和233-235,30和236-238,31和239-241,32和242-244,33和245-247,34和248-250,35和251-253,36和254-256,和/或37和257-259的序列,并且HVRxa0H1,H2,和H3序列分别是SEQxa0IDxa0NOS:48,49和/或50。还在另一个实施方案中,所述构架序列包含SEQxa0IDxa0NOS:19和203-205,20和206-208,21和209-211,22和212-214,23和215-217,24和218-220,25和221-223,26和224-226,27和227-229,28和230-232,29和233-235,30和236-238,31和239-241,32和242-244,33和245-247,34和248-250,35和251-253,36和254-256,和/或37和257-259的序列,并且HVRxa0H1,H2,和H3序列分别是SEQxa0IDxa0NOS:84,85,和/或86。在进一步的实施方案中,所述构架序列包含SEQxa0IDxa0NOS:19和203-205,20和206-208,21和209-211,22和212-214,23和215-217,24和218-220,25和221-223,26和224-226,27和227-229,28和230-232,29和233-235,30和236-238,31和239-241,32和242-244,33和245-247,34和248-250,35和251-253,36和254-256,和/或37和257-259的序列,并且HVRxa0H1,H2,和H3序列分别是SEQxa0IDNOS:108,109,和/或110。在具体的实施方案中,本发明的抗体包含轻链可变结构域,其中构架序列包含SEQxa0IDxa0NOS:38和260-262,39和263-265,40和266-268,和/或41和269-271的序列,并且HVRxa0L1,L2,和L3序列分别是SEQxa0IDNOS:16,17,和/或18。在另一个实施方案中,本发明的抗体包含轻链可变结构域,其中构架序列包含SEQxa0IDxa0NOS:38和260-262,39和263-265,40和266-268,和/或41和269-271的序列,并且HVRxa0L1,L2,和L3序列分别是SEQxa0IDxa0NOS:51,52和/或53。在另外的实施方案中,本发明的抗体包含轻链可变结构域,其中构架序列包含SEQxa0IDxa0NOS:38和260-262,39和263-265,40和266-268,和/或41和269-271的序列,并且HVRxa0L1,L2,和L3序列分别是SEQxa0IDxa0NOS:87,88和/或89。还在另一个实施方案中,本发明的抗体包含轻链可变结构域,其中构架序列包含SEQxa0IDxa0NOS:38和260-262,39和263-265,40和266-268,和/或41和269-271的序列,并且HVRxa0L1,L2,和L3序列分别是SEQxa0IDxa0NOS:111,112,和/或113。在另一个方面,本发明的抗体包含重链可变结构域和/或轻链可变结构域,所述重链可变结构域包含SEQxa0IDxa0NO:132的序列,所述轻链可变结构域包含SEQxa0IDxa0NO:133的序列。在另一个方面,本发明的抗体包含重链可变结构域和/或轻链可变结构域,所述重链可变结构域包含SEQxa0IDNO:134的序列,所述轻链可变结构域包含SEQxa0IDxa0NO:135的序列。在另一个方面,本发明的抗体包含重链可变结构域和/或轻链可变结构域,所述重链可变结构域包含SEQxa0IDxa0NO:136的序列,所述轻链可变结构域包含SEQxa0IDxa0NO:137的序列。在另一个方面,本发明的抗体包含重链可变结构域和/或轻链可变结构域,所述重链可变结构域包含SEQxa0IDxa0NO:138的序列,所述轻链可变结构域包含SEQxa0IDxa0NO:139的序列。在一个方面,本发明提供结合多肽的抗-FGFR3抗体,所述多肽包含下列的氨基酸序列,基本上由下列的氨基酸序列组成或由下列的氨基酸序列组成:LAVPAANTVRFRCPA(SEQxa0IDxa0NO:179)和/或SDVEFHCKVYSDAQP(SEQxa0IDxa0NO:180)。在一些实施方案中,所述抗体结合多肽,所述多肽包含成熟的人FGFR3氨基酸序列的氨基酸数164-178和/或269-283,基本上由成熟的人FGFR3氨基酸序列的氨基酸数164-178和/或269-283组成或由成熟的人FGFR3氨基酸序列的氨基酸数164-178和/或269-283组成。在一个实施方案中,本发明的抗-FGFR3抗体特异性地结合与序列LAVPAANTVRFRCPA(SEQxa0IDxa0NO:179)和/或SDVEFHCKVYSDAQP(SEQxa0IDxa0NO:180)具有至少50%,60%,70%,80%,90%,95%,98%序列同一性或相似性的氨基酸序列。在一个方面,本发明的抗-FGFR3抗体与FGFR3IIIb多肽的残基154,155,158,159,161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171,172,173,174,175,177,202,205,207,210,212,214,216,217,241,246,247,248,278,279,280,281,282,283,314,315,316,317和/或318,或FGFR3IIIc多肽的等效残基中的至少一个、两个、三个、四个或至多达全部的任意数目个残基结合。本领域普通技术人员理解如何比对FGFR3序列从而鉴定各个FGFR3序列之间的对应残基。两个或多个残基的组合可以包括FGFR3IIIb多肽的残基154,155,158,159,161,162,163,164,165,166,167,168,169,170,171,172,173,174,175,177,202,205,207,210,212,214,216,217,241,246,247,248,278,279,280,281,282,283,314,315,316,317和/或318,或FGFR3IIIc多肽的等效残基中的任一个。在一些实施方案中,抗-FGFR3抗体与FGFR3IIIb多肽的残基158,159,169,170,171,173,175,205,207,和/或315,或FGFR3IIIc多肽的等效残基中的至少一个、两个、三个、四个或至多达全部的任意数目个残基结合。在一些实施方案中,抗-FGFR3抗体与FGFR3IIIb多肽的残基158,170,171,173,175,和/或315,或FGFR3IIIc多肽的等效残基中的至少一个、两个、三个、四个或至多达全部的任意数目个残基结合。在一个方面,本发明提供了抗-FGFR3抗体,所述抗-FGFR3抗体与上面提及的抗体中的任一个竞争与FGFR3的结合。在一个方面,本发明提供了抗-FGFR3抗体,所述抗-FGFR3抗体结合与上面提及的抗体中的任一个所结合的相同或相似的FGFR3上的表位。如本领域中已知的那样,以及如下文更详细描述的那样,对抗体的高变区划界的抗体的氨基酸位置/边界可以根据具体情况和本领域中已知的各种定义(如下所述)而变化。可变结构域内的一些位置可以视为杂合的超变位置,因为根据一组标准这些位置可以视为处于高变区内,而根据不同组的标准这些位置可以被视为在高变区之外。这些位置中的一个或多个也可见于扩展的高变区中(如下面进一步定义)。在一些实施方案中,所述抗体是单克隆抗体。在其他实施方案中,所述抗体是多克隆抗体。在一些实施方案中,所述抗体选自由嵌合抗体、亲和力成熟抗体、人源化抗体和人抗体组成的组。在某些实施方案中,所述抗体是抗体片段。在一些实施方案中,所述抗体是Fab,Fab′,Fab′-SH,F(ab′)₂,或scFv。在一些实施方案中,FGFR3抗体是包含Fc区的单臂抗体(即,重链可变结构域和轻链可变结构域形成单个抗原结合臂),其中Fc区包含第一和第二Fc多肽,其中第一和第二Fc多肽以复合体存在并形成Fc区,所述Fc区与包含所述抗原结合臂的Fab分子相比增加所述抗体片段的稳定性。参见,例如,WO2006/015371。在一个实施方案中,所述抗体是嵌合抗体,例如,包含移植至异源的非人、人或人源化序列(例如,构架和/或恒定结构域序列)的来自非人供体的抗原结合序列的抗体。在一个实施方案中,所述非人供体是小鼠。在进一步的实施方案中,抗原结合序列是合成的,例如,通过诱变获得(例如,噬菌体展示筛选等)。在具体的实施方案中,本发明的嵌合抗体具有鼠的V区和人的C区。在一个实施方案中,鼠轻链V区与人κ轻链融合。在另一个实施方案中,鼠重链V区与人IgG1C区融合。本发明的人源化抗体包括在构架区(FR)中具有氨基酸置换的那些和在移植的CDR中有改变的亲和力成熟变体。CDR或FR中被置换的氨基酸不限于存在于供体或受体抗体中的那些。在其他的实施方案中,本发明的抗体还包含Fc区中的氨基酸残基改变,所述改变导致提高的效应子功能,包括增强的CDC和/或ADCC功能和B-细胞杀伤作用。本发明的其他抗体包括具有改善稳定性的特异性改变的那些。在其他实施方案中,本发明的抗体包含Fc区中的氨基酸残基改变,所述改变导致降低的效应子功能,例如降低的CDC和/或ADCC功能和/或减小的B-细胞杀伤作用。在一些实施方案中,本发明的抗体的特征在于与自然杀伤(NK)细胞上的人补体因子C1q和/或人Fc受体的结合减少(诸如缺乏结合)。在一些实施方案中,本发明的抗体的特征在于与人FcγRI,FcγRIIA,和/或FcγRIIIA的结合减少(诸如缺乏结合)。在一些实施方案中,本发明的抗体是IgG类(例如,IgG1或IgG4)并且包含E233,L234,G236,D265,D270,N297,E318,K320,K322,A327,A330,P331,和/或P329(根据EU指数编号)中的至少一个突变。在一些实施方案中,所述抗体包含突变L234A/L235A或D265A/N297A。在抗体包含Fc区的情况下,与其结合的糖类可以改变。例如,具有成熟的糖结构(所述糖结构缺少与抗体的Fc区连接的岩藻糖)的抗体记述在美国专利申请号USxa02003/0157108(Presta,L.)中。还参见US2004/0093621(Kyowaxa0Hakkoxa0Kogyoxa0Co.,Ltd)。在与抗体的Fc区连接的糖中具有平分型N-乙酰氨基葡糖胺(GlcNAc)的抗体参见WOxa02003/011878,Jean-Mairet等和美国专利号6,602,684,Umana等。在与抗体的Fc区连接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体在WOxa01997/30087,Patel等中报道。还参见,WOxa01998/58964(Raju,S.)和WOxa01999/22764(Raju,S.),它们涉及与抗体的Fc区连接的糖发生改变的抗体。还参见USxa02005/0123546(Umana等),其关于具有改变的糖基化作用的抗原结合分子。在一个方面,本发明提供了FGFR3结合多肽,所述多肽包含本文提供的任一个抗原结合序列,其中所述FGFR3结合多肽特异性地结合FGFR3,例如,人和/或犬和/或小鼠FGFR3。本发明的抗体结合(诸如特异性结合)FGFR3(例如,FGFR3-IIIb和/或FGFR3-IIIc),并且在一些实施方案中,可以调节(例如,抑制)FGFR3信号传导(诸如FGFR3磷酸化)中的一个或多个方面和/或破坏任何生物学相关的FGFR3和/或FGFR3配体生物学途径,和/或治疗和/或预防肿瘤、细胞增生性病症或癌症;和/或治疗或预防与FGFR3表达和/或活性(诸如增加的FGFR3表达和/或活性)相关的病症。在一些实施方案中,FGFR3抗体特异性结合由FGFR3(例如,人或小鼠FGFR3)组成或基本上由FGFR3(例如,人或小鼠FGFR3)组成的多肽。在一些实施方案中,所述抗体以1x10-7M或更强的Kd特异性结合FGFR3。在一些实施方案中,本发明的抗-FGFR3抗体不是:美国专利公开号2005/0147612中所述的抗-FGFR3抗体(例如,抗体MSPRO2,MSPRO12,MSPRO59,MSPRO11,MSPRO21,MSPRO24,MSPRO26,MSPRO28,MSPRO29,MSPRO43,MSPRO55),Rauchenberger等,Jxa0Biolxa0Chem(生物化学杂志)278(40):38194-38205(2003)中所述的抗体;PCT公开号WO2006/048877中所述的抗体(例如,抗体PRO-001),Martinez-Torrecuadrada等,Molxa0Cancerxa0Ther(分子癌症治疗)(2008)7(4):862-873中所述的抗体(例如,scFvαFGFR3xa03C),Direnzo,R等(2007)Proceedingsxa0ofxa0AACRxa0Annualxa0Meeting(AACR年会进展),摘要No.2080中所述的抗体(例如,D11),或WOxa02010/002862中所述的抗体(例如,抗体15D8,27H2,4E7,2G4,20B4)。在一个方面,本发明提供包含载体和本发明的一种或多种抗体的组合物。在一个实施方案中,所述载体是药用的。在另一个方面,本发明提供编码本发明的FGFR3抗体的核酸。还在另一个方面,本发明提供包含本发明的核酸的载体。在进一步的方面,本发明提供包含载体和本发明的一种或多种核酸的组合物。在一个实施方案中,所述载体是药用的。在一个方面,本发明提供包含本发明的核酸或载体的宿主细胞。载体可以是任何类型,例如,重组载体诸如表达载体。可以使用多种宿主细胞中的任一种。在一个实施方案中,宿主细胞是原核细胞,例如,大肠杆菌(E.coli)。在另一个实施方案中,宿主细胞是真核细胞,例如,哺乳动物细胞,诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在进一步的方面,本发明提供制备本发明的抗体的方法。例如,本发明提供制备抗-FGFR3抗体的方法(所述抗-FGFR3抗体如本文所定义其包括全长抗体及其片段),所述方法包括在合适的宿主细胞表达编码所述抗体的本发明的重组载体,并回收所述抗体。在一些实施方案中,所述方法包括培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞,使得所述核酸得以表达。在一些实施方案中,所述方法进一步包括从所述宿主细胞培养物中回收所述抗体。在一些实施方案中,所述抗体从所述宿主细胞培养基中回收。在一些实施方案中,所述方法进一步包括将回收的抗体与药用载体、赋形剂或载体组合从而制备包含所述人源化抗体的药物制剂。在一个方面,本发明提供一种包含容器的制品;和包含在容器内的组合物,其中所述组合物包含本发明的一种或多种FGFR3抗体。在一个实施方案中,所述组合物包含本发明的核酸。在另一个实施方案中,包含抗体的组合物还包含载体,在一些实施方案中所述载体是药用的。在一个实施方案中,本发明的制品还包含用于将所述组合物(例如,所述抗体)施用于个体的说明书(诸如用于本文所述的任一种方法的说明书)。在另一个方面,本发明提供一种包含第一容器和第二容器的试剂盒,所述第一容器包含组合物,所述组合物包含本发明的一种或多种抗-FGFR3抗体;所述第二容器包含缓冲剂。在一个实施方案中,所述缓冲剂是药用的。在一个实施方案中,包含抗体的组合物还包含载体,在一些实施方案中所述载体是药用的。在另一个实施方案中,试剂盒还包含用于将所述组合物(例如,所述抗体)施用于个体的说明书。在进一步的方面,本发明提供了本发明的抗-FGFR3抗体,所述抗-FGFR3抗体用作药物。在进一步的方面,本发明提供本发明的抗-FGFR3抗体,所述抗-FGFR3抗体用于治疗或预防病症,诸如与FGFR3激活和/或表达(在一些实施方案中,过表达)相关的病理学状况。在一些实施方案中,所述病症是癌症、肿瘤和/或细胞增生性病症。在一些实施方案中,所述癌症、肿瘤和/或细胞增生性病症是多发性骨髓瘤或膀胱癌症(例如,移行性细胞癌),乳腺癌或肝癌。在进一步的方面,本发明提供本发明的抗-FGFR3抗体,所述抗-FGFR3抗体用于治疗或预防病症诸如骨骼病症。在一些实施方案中,所述病症是软骨发育不全(achondroplasia)、软骨发育不良(hypochondroplasia)、侏儒症(dwarfism)、致死性发育不全(thantophoricdysplasia)(TD;临床形式TD1和TDII)或颅缝早闭综合症(craniosynostosissyndrome)。在进一步的方面,本发明提供本发明的抗-FGFR3抗体,所述抗-FGFR3抗体用于减少细胞增殖。在进一步的方面,本发明提供本发明的抗-FGFR3抗体,所述抗-FGFR3抗体用于杀伤细胞。在一些实施方案中,所述细胞是多发性骨髓瘤细胞。在一些实施方案中,所述细胞被ADCC杀伤。在一些实施方案中,所述抗体是裸抗体。在一些实施方案中,所述细胞过表达FGFR3。在进一步的方面,本发明提供本发明的抗-FGFR3抗体,所述抗-FGFR3抗体用于清除细胞,诸如多发性骨髓瘤细胞。在一些实施方案中,所述细胞被ADCC杀伤。在一些实施方案中,所述抗体是裸抗体。在一些实施方案中,所述细胞过表达FGFR3。在进一步的方面,本发明提供本发明的抗-FGFR3抗体在制备用于治疗性和/或预防性治疗病症的药物中的用途,所述病症诸如与FGFR3激活和/或表达(在一些实施方案中,过表达)相关的病理学状况。在一些实施方案中,所述病症是癌症、肿瘤和/或细胞增生性病症。在一些实施方案中,所述癌症、肿瘤和/或细胞增生性病症是多发性骨髓瘤或膀胱癌(例如,移行性细胞癌),乳腺癌或肝癌。在一些实施方案中,所述病症是骨骼病症,例如,软骨发育不全、软骨发育不良、侏儒症、致死性发育不全(TD;临床形式TD1和TDII)或颅缝早闭综合症。在一个方面,本发明提供本发明的核酸在制备用于治疗性和/或预防性治疗病症的药物中的用途,所述病症诸如与FGFR3激活和/或表达(在一些实施方案中,过表达)相关的病理学状况。在一些实施方案中,所述病症是癌症、肿瘤和/或细胞增生性病症。在一些实施方案中,所述癌症、肿瘤和/或细胞增生性病症是多发性骨髓瘤或膀胱癌(例如,移行性细胞癌),乳腺癌或肝癌。在一些实施方案中,所述病症是骨骼病症,例如,软骨发育不全、软骨发育不良、侏儒症、致死性发育不全(TD;临床形式TD1和TDII)或颅缝早闭综合症。在另一个方面,本发明提供本发明的表达载体在制备用于治疗性和/或预防性治疗病症的药物中的用途,所述病症诸如与FGFR3激活和/或表达(在一些实施方案中,过表达)相关的病理学状况。在一些实施方案中,所述病症是癌症、肿瘤和/或细胞增生性病症。在一些实施方案中,所述癌症、肿瘤和/或细胞增生性病症是多发性骨髓瘤或膀胱癌(例如,移行性细胞癌),乳腺癌或肝癌。在一些实施方案中,所述病症是骨骼病症,例如,软骨发育不全、软骨发育不良、侏儒症、致死性发育不全(TD;临床形式TD1和TDII)或颅缝早闭综合症。还在另一个方面,本发明提供本发明的宿主细胞在制备用于治疗性和/或预防性治疗病症的药物中的用途,所述病症诸如与FGFR3激活和/或表达(在一些实施方案中,过表达)相关的病理学状况。在一些实施方案中,所述病症是癌症、肿瘤和/或细胞增生性病症。在一些实施方案中,所述癌症、肿瘤和/或细胞增生性病症是多发性骨髓瘤或膀胱癌(例如,移行性细胞癌),乳腺癌或肝癌。在一些实施方案中,所述病症是骨骼病症,例如,软骨发育不全、软骨发育不良、侏儒症、致死性发育不全(TD;临床形式TD1和TDII)或颅缝早闭综合症。在进一步的方面,本发明提供本发明的制品在制备用于治疗性和/或预防性治疗病症的药物中的用途,所述病症诸如与FGFR3激活和/或表达(在一些实施方案中,过表达)相关的病理学状况。在一些实施方案中,所述病症是癌症、肿瘤和/或细胞增生性病症。在一些实施方案中,所述癌症、肿瘤和/或细胞增生性病症是多发性骨髓瘤或膀胱癌(例如,移行性细胞癌),乳腺癌或肝癌。在一些实施方案中,所述病症是骨骼病症,例如,软骨发育不全、软骨发育不良、侏儒症、致死性发育不全(TD;临床形式TD1和TDII)或颅缝早闭综合症。在进一步的方面,本发明提供本发明的试剂盒制备用于治疗性和/或预防性治疗病症的药物中的用途,所述病症诸如与FGFR3激活和/或表达(在一些实施方案中,过表达)相关的病理学状况。在一些实施方案中,所述病症是癌症、肿瘤和/或细胞增生性病症。在一些实施方案中,所述癌症、肿瘤和/或细胞增生性病症是多发性骨髓瘤或膀胱癌(例如,移行性细胞癌),乳腺癌或肝癌。在一些实施方案中,所述病症是骨骼病症,例如,软骨发育不全、软骨发育不良、侏儒症、致死性发育不全(TD;临床形式TD1和TDII)或颅缝早闭综合症。在进一步的方面,本发明提供本发明的抗-FGFR3抗体在制备用于抑制细胞增殖的药物中的用途。在进一步的方面,本发明提供本发明的抗-FGFR3抗体在制备用于细胞杀伤的药物中的用途。在一些实施方案中,所述细胞是多发性骨髓瘤细胞。在一些实施方案中,所述细胞被ADCC杀伤。在一些实施方案中,所述抗体是裸抗体。在一些实施方案中,所述细胞过表达FGFR3。在进一步的方面,本发明提供本发明的抗-FGFR3抗体在制备用于清除细胞(诸如多发性骨髓瘤细胞)的药物中的用途。在一些实施方案中,所述细胞被ADCC杀伤。在一些实施方案中,所述抗体是裸抗体。在一些实施方案中,所述细胞过表达FGFR3。本发明提供可用于调节与FGFR3的表达和/或信号传导,诸如增加表达和/或信号传导或不合乎需要的表达和/或信号传导相关的病症的方法和组合物。本发明的方法可以用来影响任何合适的病理学状态。示例性的病症如本文所述,并且包括选自由下列各项组成的组的癌症:非小细胞肺癌(non-smallxa0cellxa0lungxa0cancer),卵巢癌,甲状腺癌,睾丸癌(testicularcancer),子宫内膜癌(endometrialxa0cancer),头颈癌,脑癌(例如,神经母细胞瘤(neuroblastoma)或脑膜瘤(meningioma)),皮肤癌(例如,黑色素瘤,基底细胞癌(basalxa0cellxa0carcinoma)或鳞状细胞癌),膀胱癌(例如,移行性细胞癌),乳腺癌,胃癌,结直肠癌(CRC),肝细胞癌,子宫颈癌,肺癌,胰腺癌,前列腺癌和恶性血液病(例如,T-细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL),B-细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL),急性髓细胞白血病(AML),B-细胞恶性肿瘤,霍奇金淋巴瘤(Hodgkinxa0lymphoma)和多发性骨髓瘤)。在一些实施方案中,所述病症是侵袭性移行性细胞癌。在一些实施方案中,所述病症是多发性骨髓瘤。其他的示例性病症包括骨骼病症,诸如软骨发育不全、软骨发育不良、侏儒症、致死性发育不全(TD;临床形式TD1和TDII)或颅缝早闭综合症。在某些实施方案中,所述癌症表达FGFR3,扩增的FGFR3,易位的FGFR3,和/或突变的FGFR3。在某些实施方案中,所述癌症表达激活的FGFR3。在某些实施方案中,所述癌症表达易位的FGFR3(例如,t(4;14)易位)。在某些实施方案中,所述癌症表达组成型FGFR3。在一些实施方案中,组成型FGFR3包括酪氨酸激酶结构域和/或近膜结构域和/或配体结合结构域中的突变。在某些实施方案中,所述癌症表达配体不依赖性FGFR3。在一些实施方案中,所述癌症表达配体依赖性FGFR3。在一些实施方案中,所述癌症表达包含对应于FGFR3-IIIb^S248C的突变的FGFR3。在一些实施方案中,所述癌症表达FGFR3-IIIbxa0^S248C和/或FGFR3-IIIc^S248C。在一些实施方案中,所述癌症表达包含对应于FGFR3-IIIb^K652E的突变的FGFR3。在一些实施方案中,所述癌症表达FGFR3-IIIbxa0^K652E和/或FGFR3-IIIcxa0^K650E。FGFR3包含对应于FGFR3-IIIb^S249C的突变。在一些实施方案中,所述癌症表达FGFR3-IIIb^S249C和/或FGFR3-IIIcxa0^S249C。在一个方面,所述癌症表达包含对应于FGFR3-IIIb^G372C的突变的FGFR3。在一些实施方案中,所述癌症表达FGFR3-IIIb^G372C和/或FGFR3-IIIcxa0^G370C。在一个方面,所述癌症表达包含对应于FGFR3-IIIb^Y375C的突变的FGFR3。在一些实施方案中,所述癌症表达FGFR3-IIIb^Y375C和/或FGFR3-IIIc^Y373C。在一些实施方案中,所述癌症表达(a)FGFR3-IIIb^K652E和(b)FGFR3-IIIb^R248C,FGFR3-IIIb^Y375C,FGFR3-IIIb^S249C,和FGFR3IIIbxa0^G372C中的一种或多种。在一些实施方案中,所述癌症表达(a)FGFR3-IIIb^R248C和(b)FGFR3-IIIb^K652E,FGFR3-IIIb^Y375C,FGFR3-IIIb^S249C,和FGFR3-IIIb^G372C中的一种或多种。在一些实施方案中,所述癌症表达(a)FGFR3-IIIb^G372C和(b)FGFR3-IIIb^K652E,FGFR3-IIIb^Y375C,FGFR3-IIIb^S249C,和FGFR3-IIIb^R248C中的一种或多种。在一些实施方案中,所述癌症表达FGFR3-IIIb^R248C,FGFR3-IIIb^K652E,FGFR3-IIIb^Y375C,FGFR3-IIIbxa0^S249C,和FGFR3-IIIbxa0^G372C。在某些实施方案中,所述癌症表达相对于对照样品(例如,正常组织的样品)或水平增加水平的磷酸-FGFR3,磷酸-FRS2和/或磷酸-MAPK。在一些实施方案中,所述癌症表达(例如,在细胞表面上)约10,000个FGFR3分子/细胞或更多(诸如11,000,12,000,13,000,14,000,15,000,16,000,17,000,18,000或更多个FGFR3受体)。在一些实施方案中,所述癌症表达约13000个FGFR3分子。在其他实施方案中,所述癌症表达约5000,6000,7000,8000,或更多个FGFR3分子。在一些实施方案中,所述癌症表达小于约4000,3000,2000,1000,或更少个FGFR3分子。在一些实施方案中,所述癌症表达小于约1000个FGFR3分子。在一个实施方案中,在本发明的方法中被靶向的细胞是癌细胞。例如,癌细胞可以是选自由下列各项组成的组的一种:乳腺癌细胞,结直肠癌细胞,肺癌细胞(例如,非小细胞肺癌细胞),甲状腺癌细胞,多发性骨髓瘤细胞,睾丸癌细胞,乳头状癌(papillaryxa0carcinoma)细胞,结肠癌细胞,胰腺癌细胞,卵巢癌细胞,宫颈癌细胞,中枢神经细胞癌细胞,骨源性肉瘤(osteogenicxa0sarcoma)细胞,肾癌细胞,肝细胞癌细胞,膀胱癌细胞(例如,移行性细胞癌细胞),胃癌细胞,头颈鳞状癌细胞,黑色素瘤细胞,白血病细胞,多发性骨髓瘤细胞(例如,包含t(4∶14)FGFR3易位的多发性骨髓瘤细胞)和结肠腺瘤细胞。在一个实施方案中,在本发明的方法中被靶向的细胞是过度增生和/或增生的细胞。在另一个实施方案中,在本发明的方法中被靶向的细胞是异常增生细胞(dysplasticxa0cell)。还在另一个实施方案中,在本发明的方法中被靶向的细胞是转移细胞。在一个方面,本发明提供抑制受试者中的细胞增殖的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的抗-FGFR3抗体以减少细胞增殖。在一个方面,本发明提供杀伤受试者中的细胞的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的抗-FGFR3抗体以杀伤细胞。在一些实施方案中,所述细胞是多发性骨髓瘤细胞。在一些实施方案中,所述细胞被ADCC杀伤。在一些实施方案中,所述抗体是裸抗体。在一些实施方案中,所述细胞过表达FGFR3。在一个方面,本发明提供清除受试者中的细胞(诸如多发性骨髓瘤细胞)的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的抗-FGFR3抗体以杀伤细胞。在一些实施方案中,所述细胞被ADCC杀伤。在一些实施方案中,所述抗体是裸抗体。在一些实施方案中,所述细胞过表达FGFR3。在一个方面,本发明提供治疗或预防骨骼病症的方法。在一些实施方案中,所述病症是软骨发育不全、软骨发育不良、侏儒症、致死性发育不全(TD;临床形式TD1和TDII)或颅缝早闭综合症。本发明的方法可以进一步包括附加的治疗步骤。例如,在一个实施方案中,一种方法进一步包括一个步骤,在所述步骤中被靶向的细胞和/或组织(例如,癌细胞)暴露于放射治疗或化疗剂。在一个方面,本发明提供了下述方法,所述方法包括施用有效量的抗-FGFR3抗体结合有效量的另一种治疗剂(诸如抗-血管生成剂,另一种抗体,化疗剂,细胞毒性剂,免疫抑制剂,前药,细胞因子,细胞毒性放射治疗,皮质类固醇,止吐剂,癌症疫苗,止痛剂,或生长抑制剂)。例如,抗-FGFR3抗体与抗癌剂或抗血管生成剂联合使用以治疗多种肿瘤或非肿瘤病症。在具体的实例中,抗-FGFR3抗体与下列联合使用:万珂(velcade),来那度胺(revlimid),他莫昔芬(tamoxifen),来曲唑(letrozole),依西美坦(exemestane),阿那曲唑(anastrozole),伊立替康(irinotecan),西妥昔单抗(cetuximab),氟维司群(fulvestrant),长春瑞滨(vinorelbine),贝伐珠单抗(bevacizumab),长春新碱(vincristine),顺铂(cisplain),吉西他滨(gemcitabine),甲氨蝶呤(methotrexate),长春碱(vinblastine),卡铂(carboplatin),紫杉醇(paclitaxel),多西他赛(docetaxel),培美曲塞(pemetrexed),5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil),多柔比星(doxorubicin),硼替佐米(bortezomib),来那度胺(lenalidomide),地塞米松(dexamethasone),马法兰(melphalin),泼尼松(prednisone),长春新碱(vincristine)和/或沙利度胺(thalidomide)。取决于待治疗的具体癌症适应证,本发明的联合疗法可以与附加的治疗剂诸如化疗剂,或附加的疗法诸如放疗或手术结合。许多已知的化疗剂可以用于本发明的联合疗法中。优选使用为用于治疗所述具体适应证的标准的那些化疗剂。要联合使用的每种治疗剂的剂量或频次优选与当不使用其他一种或多种药剂时相应治疗剂的剂量或频次相同,或小于相应治疗剂的剂量或频次。在另一个方面,本发明提供本文所述的任一种抗-FGFR3抗体,其中所述抗-FGFR3抗体包含可检测的标记物。在另一个方面,本发明提供本文所述的任一种抗-FGFR3抗体和FGFR3的复合体。在一些实施方案中,所述复合体在体内或体外。在一些实施方案中,所述复合体包含癌细胞。在一些实施方案中,抗-FGFR3抗体被可检测地标记。附图简要说明图1A,1B和1C:抗-FGFR3抗体的重链和轻链HVR环序列。所述附图显示重链HVR序列,H1,H2和H3,以及轻链HVR序列,L1,L2,和L3。序列编号如下:克隆184.6(HVR-H1是SEQxa0IDxa0NO:1;HVR-H2是SEQxa0IDxa0NO:2;HVR-H3是SEQxa0IDxa0NO:3;HVR-L1是SEQxa0IDxa0NO:4;HVR-L2是SEQxa0IDNO:5;HVR-L3是SEQxa0IDxa0NO:6);克隆184.6.1(HVR-H1是SEQxa0IDxa0NO:7;HVR-H2是SEQxa0IDxa0NO:8;HVR-H3是SEQxa0IDxa0NO:9;HVR-L1是SEQxa0IDxa0NO:10;HVR-L2是SEQxa0IDNO:11;HVR-L3是SEQxa0IDxa0NO:12)克隆184.6.58(HVR-H1是SEQxa0IDxa0NO:13;HVR-H2是SEQxa0IDxa0NO:14;HVR-H3是SEQxa0IDxa0NO:15;HVR-L1是SEQxa0IDxa0NO:16;HVR-L2是SEQxa0IDNO:17;HVR-L3是SEQxa0IDxa0NO:18)克隆184.6.62(HVR-H1是SEQxa0IDxa0NO:48;HVR-H2是SEQxa0IDxa0NO:49;HVR-H3是SEQxa0IDxa0NO:50;HVR-L1是SEQxa0IDxa0NO:51;HVR-L2是SEQxa0IDNO:52;HVR-L3是SEQxa0IDxa0NO:53)克隆184.6.21(HVR-H1是SEQxa0IDxa0NO:54;HVR-H2是SEQxa0IDxa0NO:55;HVR-H3是SEQxa0IDxa0NO:56;HVR-L1是SEQxa0IDxa0NO:57;HVR-L2是SEQxa0IDNO:58;HVR-L3是SEQxa0IDxa0NO:59)克隆184.6.49(HVR-H1是SEQxa0IDxa0NO:60;HVR-H2是SEQxa0IDxa0NO:61;HVR-H3是SEQxa0IDxa0NO:62;HVR-L1是SEQxa0IDxa0NO:63;HVR-L2是SEQxa0IDNO:64;HVR-L3是SEQxa0IDxa0NO:65)克隆184.6.51(HVR-H1是SEQxa0IDxa0NO:66;HVR-H2是SEQxa0IDxa0NO:67;HVR-H3是SEQxa0IDxa0NO:68;HVR-L1是SEQxa0IDxa0NO:69;HVR-L2是SEQxa0IDNO:70;HVR-L3是SEQxa0IDxa0NO:71)克隆184.6.52(HVR-H1是SEQxa0IDxa0NO:72;HVR-H2是SEQxa0IDNO:73;HVR-H3是SEQxa0IDxa0NO:74;HVR-L1是SEQxa0IDxa0NO:75;HVR-L2是SEQxa0IDxa0NO:76;HVR-L3是SEQxa0IDxa0NO:77)克隆184.6.92(HVR-H1是SEQxa0IDxa0NO:78;HVR-H2是SEQxa0IDNO:79;HVR-H3是SEQxa0IDxa0NO:80;HVR-L1是SEQxa0IDxa0NO:81;HVR-L2是SEQxa0IDxa0NO:82;HVR-L3是SEQxa0IDxa0NO:83)克隆184.6.1.N54S(HVR-H1是SEQxa0IDxa0NO:84;HVR-H2是SEQxa0IDNO:85;HVR-H3是SEQxa0IDxa0NO:86;HVR-L1是SEQxa0IDxa0NO:87;HVR-L2是SEQxa0IDxa0NO:88;HVR-L3是SEQxa0IDxa0NO:89)克隆184.6.1.N54G(HVR-H1是SEQxa0IDxa0NO:90;HVR-H2是SEQxa0IDNO:91;HVR-H3是SEQxa0IDxa0NO:92;HVR-L1是SEQxa0IDxa0NO:93;HVR-L2是SEQxa0IDxa0NO:94;HVR-L3是SEQxa0IDxa0NO:95)克隆184.6.1.N54A(HVR-H1是SEQxa0IDxa0NO:96;HVR-H2是SEQxa0IDNO:97;HVR-H3是SEQxa0IDxa0NO:98;HVR-L1是SEQxa0IDxa0NO:99;HVR-L2是SEQxa0IDxa0NO:100;HVR-L3是SEQxa0IDxa0NO:101)克隆184.6.1.N54Q(HVR-H1是SEQxa0IDxa0NO:102;HVR-H2是SEQIDxa0NO:103;HVR-H3是SEQxa0IDxa0NO:104;HVR-L1是SEQxa0IDxa0NO:105;HVR-L2是SEQxa0IDxa0NO:106;HVR-L3是SEQxa0IDxa0NO:107)克隆184.6.58.N54S(HVR-H1是SEQxa0IDxa0NO:108;HVR-H2是SEQIDxa0NO:109;HVR-H3是SEQxa0IDxa0NO:110;HVR-L1是SEQxa0IDxa0NO:111;HVR-L2是SEQxa0IDxa0NO:112;HVR-L3是SEQxa0IDxa0NO:113)克隆184.6.58.N54G(HVR-H1是SEQxa0IDxa0NO:114;HVR-H2是SEQIDxa0NO:115;HVR-H3是SEQxa0IDxa0NO:116;HVR-L1是SEQxa0IDxa0NO:117;HVR-L2是SEQxa0IDxa0NO:118;HVR-L3是SEQxa0IDxa0NO:119)克隆184.6.58.N54A(HVR-H1是SEQxa0IDxa0NO:120;HVR-H2是SEQIDxa0NO:121;HVR-H3是SEQxa0IDxa0NO:122;HVR-L1是SEQxa0IDxa0NO:123;HVR-L2是SEQxa0IDxa0NO:124;HVR-L3是SEQxa0IDxa0NO:125)克隆184.6.58.N54Q(HVR-H1是SEQxa0IDxa0NO:126;HVR-H2是SEQIDxa0NO:127;HVR-H3是SEQxa0IDxa0NO:128;HVR-L1是SEQxa0IDxa0NO:129;HVR-L2是SEQxa0IDxa0NO:130;HVR-L3是SEQxa0IDxa0NO:131)。克隆184.6.1.NSxa0D30E(HVR-H1是SEQxa0IDxa0NO:143;HVR-H2是SEQxa0IDxa0NO:144;HVR-H3是SEQxa0IDxa0NO:145;HVR-L1是SEQxa0IDxa0NO:140;HVR-L2是SEQxa0IDxa0NO:141;HVR-L3是SEQxa0IDxa0NO:142)。氨基酸位置根据下述Kabat编号系统进行编号。图2A和2B:描绘了(A)抗-FGFR3抗体184.6.1.N54S,184.6.58,和184.6.62的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列;和(B)抗-FGFR3抗体1G6,6G1,和15B2的高变区。图3A,3B,和4:描绘了示例性的接纳体(acceptor)人共有构架序列,其用于使用如下的序列标识符实施本发明:可变重链(VH)共有构架(图3A,3B)人VH亚组I共有构架减去Kabatxa0CDRs(SEQxa0IDxa0NOS:19和203-205)人VH亚组I共有构架减去延伸的高变区(SEQxa0IDxa0NOS:20和206-208,21和209-211,22和212-214)人VH亚组II共有构架减去Kabatxa0CDRs(SEQxa0IDxa0NOS:23和215-217)人VH亚组II共有构架减去延伸的高变区(SEQxa0IDxa0NOS:24和218-220,25和221-223,26和224-226)人VH亚组II共有构架减去延伸的人VH亚组III共有构架减去Kabatxa0CDRs(SEQxa0IDxa0NOS:27和227-229)人VH亚组III共有构架减去延伸的高变区(SEQxa0IDxa0NOS:28和230-232,29和233-235,30和236-238)人VH接纳体构架减去Kabatxa0CDRs(SEQxa0IDxa0NOS:31和239-241)人VH接纳体构架减去延伸的高变区(SEQxa0IDxa0NOS:32和242-244,33和2245-247)人VH接纳体2构架减去Kabatxa0CDRs(SEQxa0IDxa0NOS:34和248-250)人VH接纳体2构架减去延伸的高变区(SEQxa0IDxa0NOS:35和251-253,36和254-256,37和257-259)可变轻链(VL)共有构架(图4)人VLκ亚组I共有构架(SEQxa0IDxa0NO:38和260-262)人VLκ亚组II共有构架(SEQxa0IDxa0NO:39和263-265)人VLκ亚组III共有构架(SEQxa0IDxa0NO:40和266-268)人VLκ亚组IV共有构架(SEQxa0IDxa0NO:41和269-271)图5:描绘了huMAb4D5-8轻链(SEQxa0IDxa0NOS:42-45)和重链(SEQxa0IDNOS:46,47,175,176)的构架区序列。上标/粗体中的数字表示按照Kabat的氨基酸位置。图6:描绘了huMAb4D5-8轻链(SEQxa0IDxa0NOS:42,43,177,45)和重链(SEQxa0IDxa0NOS:46,47,178,和176)的修饰/变体的构架区序列。上标/粗体中的数字表示按照Kabat的氨基酸位置。上标/粗体中的数字表示按照Kabat的氨基酸位置。图7:在膀胱癌细胞RT112中敲低FGFR3抑制增殖并在体外诱导G1细胞周期停滞,并在体内抑制肿瘤生长。将三种不同的FGFR3shRNA克隆进Tet-可诱导型表达载体中。使用嘌呤霉素选择建立稳定表达FGFR3shRNAs或对照shRNA的RT112细胞。(A)在选择的用强力霉素处理或未用强力霉素(Dox,0,0.1和1μg/ml,从左至右)处理的克隆中显示FGFR3表达的代表性印迹.(B)RT112稳定细胞的[³H]-胸苷的掺入。将RT112稳定的克隆用或不用1μg/ml强力霉素培养3天,然后与[³H]-胸苷(1μCi/孔)温育16小时。掺入的[³H]-胸苷的计数针对来自没有使用强力霉素诱导的细胞的计数进行标准化。误差条代表SEM。(C)RT112稳定细胞的DNA荧光流式细胞仪直方图。表达对照shRNA或FGFR3xa0shRNA4的RT112克隆用或不用1μg/ml强力霉素培养72小时,并用碘化丙啶(PI)染色细胞核。对FGFR3xa0shRNA2和6获得类似的结果(图16)。(D)表达对照shRNA(每个处理组n=9)或FGFR3xa0shRNA4(每个处理组n=11)的RT112细胞在小鼠中的生长。小鼠单独给予5%蔗糖或补充以1mg/ml强力霉素,并且一周测量肿瘤大小两次。误差条代表SEM。对FGFR3shRNA2和6获得类似的结果(图16)。下部图片:从对照shRNA或FGFR3shRNA4稳定细胞异种移植物组织中提取的肿瘤裂解产物中FGFR3蛋白的表达。图8:R3Mab阻断FGF/FGFR3相互作用。(A)R3Mab对人FGFR3的选择性结合。人FGFR1-4Fc嵌合蛋白被固定并与渐增量的R3Mab温育。使用抗-人Fab抗体检测特异性结合。(B-C)R3Mab阻断FGF1与人FGFR3-IIIb(B)或IIIc(C)的结合。使用生物素化的FGF1-特异性多克隆抗体检测特异性结合。(D-E)R3Mab阻断FGF9与人FGFR3-IIIb(D)或IIIc(E)的结合。使用生物素化的FGF9-特异性多克隆抗体检测特异性结合。误差条代表平均值的标准误差(SEM)并且有时小于符号。图9:R3Mab抑制由野生型和突变的FGFR3驱动的Ba/F3细胞增殖。(A)R3Mab对表达野生型人FGFR3-IIIb的Ba/F3细胞的活力的抑制作用。细胞在不含FGF1(无FGF1)的培养基中培养,或在单独的10ng/mlxa0FGF1加10μg/ml肝素(FGF1)的存在下培养,或结合对照抗体(Control)或R3Mab培养。在与抗体温育72小时后用CellTiter-Glo(Promega)评价细胞活力。(B)在Ba/F3-FGFR3-IIIbWT稳定的细胞中R3Mab对FGFR3和MAPK磷酸化的抑制。将细胞用15ng/mlxa0FGF1和10μg/ml肝素(+)或单独肝素(-)处理10分钟,然后与对照Ab(Ctrl),递减量的PBS中的R3Mab(分别为1,0,2,0.04μg/ml),或单独PBS(模拟(Mock))预温育3小时。裂解产物用分别针对pFGFRY^653/654和pMAPK^{Thr202/Tyr204}的抗体进行免疫印迹以评价FGFR3和p44/42MAPK的磷酸化。(C)基于发表的数据的膀胱癌中FGFR3突变热点和频次的示意性图示(绘制的序列编号基于FGFR3IIIb同种型氨基酸序列)(32)。TM,跨膜结构域;TK1和TK2,酪氨酸激酶结构域1和2。(D-H)R3Mab对表达癌相关FGFR3突变体的Ba/F3细胞的活力的抑制作用。G372C来自IIIc同种型,且其余的来自IIIb同种型。对于所有突变体的序列编号基于FGFR3IIIb同种型氨基酸序列(包括G372C突变体,其将基于FGFR3IIIc同种型氨基酸序列编号为G370C)。如(A)中所述在与抗体温育72小时后评价细胞活力。误差条表示SEM。图10:R3Mab的表位作图以及R3Mabxa0Fab片段和人FGFR3-IIIb的IgD2-D3之间的复合体的晶体结构。(A)通过跨越人FGFR3的IgD2-D3的13个肽与R3Mab的结合确定的表位。每个生物素化的肽被俘获在链霉抗生物素蛋白(streptavidin)包被的微量滴定孔上并与R3Mab温育。使用山羊抗人IgG抗体检测特异性结合的R3Mab。(B)人FGFR3肽3(LAVPAANTVRFRCPA(SEQxa0IDxa0NO:179)和11(SDVEFHCKVYSDAQP(SEQxa0IDxa0NO:180)与人FGFR1的细胞外区段(肽3:HAVPAAKTVKFKCPS(SEQxa0IDxa0NO:181);肽11:SNVEFMCKVYSDPQP(SEQxa0IDxa0NO:182))的序列比对。参与初级FGF2-FGFR1相互作用、肝素结合、和受体-受体缔合的FGFR1残基分别以粗体、斜体和下划线的字体显示。FGFR1残基的功能比对基于Plotnikov等(34)。(C)与人FGFR3IgD2-D3(显示在分子表面,白色)形成复合体的R3Mabxa0Fab(显示为丝带-螺旋,轻链灰色,重链黑色)的结构。参与配体结合和二聚作用的受体残基基于Plotnikov等(34)分别以灰色/阴影交叉线和深灰色着色。(D)晶体结构的特写显示来自Fab的CDR-H3和-H2构成与FGFR3的IgD2和IgD3的主要相互作用位点。(E)FGFR3-IIIc-FGF1复合体(PDB代码1RY7)与FGFR3-IIIb-Fab复合体的重叠。FGFR3-IIIc和FGF1分别以灰色和深灰色着色。FGFR3-IIIb以白色显示,且Fab以浅灰色显示轻链,深灰色显示重链。IgD2用作用于重叠的锚。注意当被R3Mab结合时来自两个结构的重叠良好的IgD2和FGFR3-IIIb的IgD3所采取的新构象。(F)FGFR3-IIIc-FGF1复合体(PDB代码1RY7)与FGFR3-IIIb-Fab复合体重叠的另一图示。FGFR3-IIIc和FGF1显示为分子表面,它们分别是灰色/网状构造和深灰色/斑点构造。FGFR3-IIIb显示为白色且Fab以灰色显示轻链,黑色显示重链。IgD2用作用于重叠的锚。注意当被R3Mab结合时来自两个结构的重叠良好的IgD2和FGFR3-IIIb的IgD3所采取的新构象。图11:R3Mab抑制表达野生型或突变的FGFR3^S249C的膀胱癌细胞中的增殖、克隆性生长和FGFR3信号传导。(A)在膀胱癌细胞系RT112中R3Mab抑制[³H]-胸苷掺入。误差条代表SEM。(B)在膀胱癌细胞系RT112中与单独处理培养基(Mock)或对照抗体(Ctrl)相比较,R3Mab(15μg/ml)阻断FGF1-激活的FGFR3信号传导。细胞裂解物用抗-FGFR3抗体免疫沉淀并用抗磷酸-酪氨酸抗体(4G10)评价FGFR3磷酸化。将裂解物免疫印迹以检测AKT(pAKT^S473)和p44/42MAPK(pMAPK^{Thr202/Tyr204})的磷酸化。(C)在膀胱癌细胞系UMUC-14(携带FGFR3^S249C)中与单独处理培养基(Mock)或对照抗体(Ctrl)相比较,R3Mab(10μg/ml)抑制克隆性生长。(D)(C)中研究的定量,从12个孔的复孔报告每孔直径大于120μm的集落数。误差条代表SEM。P<3.4X10^-9相对于Mock或Ctrl。(E)在UMUC-14细胞中R3Mab(15μg/ml)抑制FGFR3磷酸化。如(B)中那样分析FGFR3磷酸化。注意在此细胞系中FGFR3的组成型磷酸化。图12:R3Mab通过将二聚体-单体平衡朝向单体状态驱动来减少二硫化物连接的FGFR3^S249C二聚体的稳态水平。(A)在UMUC-14细胞中R3Mab对FGFR3^S249C二聚体的作用。将细胞与R3Mab(15μg/ml)或对照抗体(Ctrl)温育3小时,且通过在非还原和还原条件下的免疫印迹来分析全细胞裂解物。(B)在UMUC-14细胞中游离巯基阻断剂DTNB对FGFR3^S249C二聚体-单体平衡的作用。将UMUC-14细胞用渐增浓度的DTNB处理3小时,如(A)中那样分析细胞裂解物。(C)在体外R3Mab对纯化的重组FGFR3^S249C二聚体的作用。由IgD2-D3构成的FGFR3^S249C二聚体通过尺寸排阻柱纯化,并与PBS(Mock),对照抗体(Ctrl),或R3Mab在37°C下温育。在指定的时间收集样品用于在非还原条件下进行免疫印迹分析。使用抗-FGFR3杂交瘤抗体6G1(A-C)检测FGFR3二聚体-单体。图13:R3Mab抑制膀胱癌细胞的异种移植物生长和Ba/F3-FGFR3^S249C的同种异体移植物生长。(A)与赋形剂(vehicle)对照相比,R3Mab对预先形成的RT112膀胱癌异种移植物的生长的作用。每组n=10。(B)R3Mab抑制RT112肿瘤组织中的FGFR3信号传导。在独立的实验中,收集用15mg/kg对照抗体(Ctrl)或R3Mab处理48小时或72小时的RT112异种移植物肿瘤(每组n=3),匀浆并通过免疫印迹分析FRS2α和MAPK激活。(C)R3Mab对预先形成的Ba/F3-FGFR3^S249C同种异体移植物的生长的作用。每组n=10。(D)R3Mab对预先形成的UMUC-14膀胱异种移植物的生长的作用,每组n=10。(E)在UMUC-14肿瘤组织中R3Mab对FGFR3^S249C二聚体和信号传导的作用。收集用30mg/kg对照抗体(Ctrl)或R3Mab处理24小时或72小时的UMUC-14异种移植物肿瘤(每组n=3),匀浆并通过免疫印迹分析FGFR3^S249C二聚体-单体以及MAPK激活。使用抗-FGFR3兔多克隆抗体sc9007检测FGFR3二聚体-单体以避免来自肿瘤裂解物中小鼠IgG的干扰。误差条代表SEM。图14:在t(4;14)阳性多发性骨髓瘤模型中,ADCC有助于R3Mab的抗-肿瘤功效。(A-B)R3Mab对预先形成的OPM2(A)和KMS11(B)骨髓瘤异种移植物的生长的作用。每组n=10。(C-F)在细胞培养中R3Mab诱导的骨髓瘤细胞系OPM2(C)和KMS11(D),或膀胱癌细胞系RT112(E)和UMUC-14(F)的细胞裂解。骨髓瘤或膀胱癌细胞与新鲜分离的人PBMC在R3Mab或对照抗体的存在下温育。细胞毒性通过测量上清液中释放的LDH来测定。(G-H)R3Mab或其DANA突变体对预先形成的OPM2(G)和KMS11(H)骨髓瘤异种移植物的生长的作用。每组n=10。误差条代表SEM并且有时小于符号。图15:用siRNA敲低FGFR3抑制膀胱癌细胞系的细胞增殖。在Genentech设计和合成6-7种不同的FGFR3xa0siRNAs和三种非特异性对照siRNA。将膀胱癌细胞系RT112(A),SW780(B),RT4(C)和UMUC-14(D)接种至96孔板(3000细胞/孔)中并使其贴壁过夜,并且用与RNAiMax(Invitrogen)形成复合体的25nMxa0siRNA瞬时转染。转染后72hr,将[³H]-胸苷(1μCi/孔)加入至培养物(A,C,和D)中进行另外16小时温育。掺入的[³H]-胸苷用TopCount定量。数据针对来自用单独RNAiMax转染的细胞(Mock)的数据进行标准化。误差条代表SEM。下部图片:显示siRNA转染的细胞中FGFR3表达的代表性印迹。(B)转染后96小时用CellTiter-Glo(Promega)测量细胞活力。误差条代表SEM。图16:在膀胱癌细胞系RT112中敲低FGFR3在体外诱导G1细胞周期停滞,并在体内抑制肿瘤生长。设计三种不同的FGFR3RNA并克隆至Tet-诱导型shRNA表达逆转录病毒载体中。采用嘌呤霉素选择建立表达FGFR3shRNA或对照shRNA的RT112稳定的克隆。(A)在用或不用1μg/ml强力霉素处理72小时后从表达FGFR3shRNA2或shRNA6的RT112稳定的细胞获得的碘化丙啶(PI)-染色的细胞核的DNA荧光流式细胞仪直方图。(B)表达FGFR3shRNA2-4(每个处理组n=11)或FGFR3shRNA6-16(每个处理组n=10)的RT112稳定的细胞在nu/nu小鼠中的生长。荷瘤小鼠接受仅5%蔗糖(实心圆圈)或5%蔗糖加1mg/ml强力霉素(实心方形),并且用测径器测量肿瘤一周两次。误差条代表SEM。图17:抗-FGFR3杂交瘤抗体16G,6G1和15B2对由野生型和突变的FGFR3驱动的Ba/F3细胞增殖的作用。抗-FGFR3杂交瘤抗体通过用人FGFR3-IIIb/Fc或人FGFR3-IIIc/Fc嵌合体免疫BALB/c小鼠产生。在来自ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="277"/>杂交瘤选择试剂盒(StemCellxa0Technologies,Inc.,Vancouver,BC,Canada)的培养基D中使用次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷选择来选择融合的杂交瘤细胞。相继地通过ELISA筛选杂交瘤抗体结合FGFR3-IIIb和FGFR3-IIIc的能力并通过FACS识别细胞表面FGFR3。然后将选择的杂交瘤通过有限稀释克隆。类似于图9A中所述,16G,6G1和15B2是用来评价对表达野生型或突变的FGFR3的Ba/F3细胞增殖的作用的克隆。误差条代表SEM。图18:通过肽谱和晶体结构分析确定的R3Mab表位的比较。(A)由与人FGFR3的细胞外IgD2-D3区段形成复合体的R3Mabxa0Fab片段的结构揭示的表位。与Fab重链和轻链接触的FGFR3残基分别用黑色和灰色着色。(B)FGFR3上肽3和11的位置。图19:在包含野生型或突变的FGFR3^S249C的膀胱癌细胞中,R3Mab抑制增殖和FGFR3信号传导。(A)在膀胱癌细胞系RT4中R3Mab抑制细胞活力。在与抗体温育96hr后用CellTiter-Glo(Promega)评价细胞活力。误差条代表SEM。(B)在膀胱癌细胞系RT4中R3Mab(15ug/ml)阻断FGF1-激活的FGFR3信号传导。(C)在膀胱癌细胞系RCC-97-7(包含FGFR3^S249C)中,R3Mab抑制[³H]-胸苷掺入。误差条代表SEM。(D)在TCC-97-7细胞中,R3Mab(15ug/ml)抑制FGFR3磷酸化。(E)与对照抗体(Ctrl)相比,在与R3Mab(15ug/ml)温育3小时后TCC-97-7细胞中的FGFR3^S249C二聚体减少。图20:在UMUC-14细胞中,胞吞作用抑制剂对R3Mab和FGFR3^S249C二聚体的内在化的作用。(A)胞吞作用抑制剂对R3Mab的内在化的作用。将用各种胞吞作用抑制剂或DMSO在37°C下预处理1小时的UMUC-14细胞与R3Mab(15ug/ml)在37°C下温育3小时以允许内在化。使用低pH洗涤来移除细胞表面R3Mab从而使内在化的抗体可视化。固定细胞并用Alexaxa0488-标记的抗-人IgG染色细胞。使用共聚焦显微镜摄取图像。(B)在用R3Mab处理的UMUC-14细胞中,胞吞作用抑制剂对FGFR3^S249C二聚体的作用。将用各种胞吞作用抑制剂或DMSO在37°C下预处理1小时的UMUC-14细胞与载体对照(mock)(1道),对照抗体(2道),或R3Mab(15ug/ml,3道)在37°C下温育3小时。细胞裂解物在非还原或还原条件下通过免疫印迹分析FGFR3蛋白。注意氯丙嗪(网格蛋白介导的胞吞作用的抑制剂)和染料木素(胞吞作用的pan-抑制剂(pan-inhibitor))阻断R3Mab内在化,但对R3Mab诱导的FGFR3^S249C二聚体减少没有作用。图21:不同抗-FGFR3抗体在非还原条件下针对单体和二聚体FGFR3^S249C的检测灵敏度。在用R3Mab(1道),对照IgG1(2道),或PBS(3道)处理3小时后,将UMUC-14细胞裂解,并将细胞裂解物在还原或非还原条件下进行免疫印迹分析。注意6G1(在Genentech产生的鼠杂交瘤抗体)检测FGFR3^S249C二聚体和单体两者,而sc9007(兔多克隆抗体,SantaCruzxa0Biotechnology)或sc13121(鼠杂交瘤抗体,Santaxa0Cruzxa0Biotechnology)优先地检测二聚体FGFR3^S249C。图22:R3Mab对t(4;14)+多发性骨髓瘤细胞的增殖的作用。(A)R3Mab对UTMC-2细胞的[³H]-胸苷掺入的抑制作用。UTMC-2细胞在包含R3Mab或对照抗体的培养基中在25ng/mlxa0FGF9和5ug/ml肝素或单独肝素(无FGF9)的存在下生长。温育6天后,加入[³H]-胸苷温育16hr。数据针对来自在缺少FGF9和抗体的条件下生长的细胞的数据进行标准化。(B-C)R3Mab对OPM2(B)和KMS11(C)细胞的[³H]-胸苷掺入的作用。生长在1.5%FBS培养基中的细胞用R3Mab或对照抗体处理6天。数据针对来自未处理的细胞的数据进行标准化。误差条代表SEM。图23:骨髓瘤和膀胱癌细胞中FGFR3的细胞表面表达水平。(A)通过FACS分析评估的骨髓瘤细胞和膀胱癌细胞中的细胞表面FGFR3表达。细胞用藻红蛋白-缀合的针对人FGFR3的小鼠mAb(FAB766P,R&DSystems)或藻红蛋白-缀合的同种型对照小鼠IgG1(BDxa0Pharmingen)染色。(B)骨髓瘤细胞和膀胱癌细胞中FGFR3密度的Scatchard分析。R3Mab被放射性碘化并与细胞在含有过量未标记的抗体的悬浮液中温育。在RT下温育2小时后,细胞通过离心沉淀,并洗涤两次。测定特异性结合的¹²⁵I。受体密度和结合亲合力(Kd)代表两次结合实验的平均值。图24:R3Mab或其DANA突变体对膀胱癌细胞的异种移植物生长的作用。(A)R3Mab和其DANA突变体(各自50mg/kg)对预先形成的RT112肿瘤的生长的作用。(B)R3Mab和其DANA突变体(各自50mg/kg)对预先形成的UMUC-14肿瘤的生长的作用。误差条代表SEM。发明详述本发明在本文中提供可用于例如,治疗或预防与FGFR3的表达和/或活性,诸如增加的表达和/或活性或不合乎需要的表达和/或活性相关的疾病状态的抗-FGFR3抗体。在一些实施方案中,本发明的抗体用来治疗肿瘤、癌症和/或细胞增生性病症。在另一个方面,本发明的抗-FGFR3抗体具有用作检测和/或分离FGFR3,诸如在多种组织和细胞类型中检测FGFR3的试剂的用途。本发明进一步提供制备和使用抗-FGFR3抗体、和编码抗-FGFR3抗体的多核苷酸的方法。通用技术本文所述或参考的技术和方法通常是本领域技术人员充分了解的并且使用常规方法普遍地采用的,诸如例如,在下述参考文献中所述广泛使用的方法:Sambrook等,分子克隆:实验室手册(Molecularxa0Cloning:ALaboratoryxa0Manual),第3版(2001)冷泉港实验室出版社,冷泉港,N.Y.现代分子生物学实验技术(CURRENTxa0PROTOCOLSxa0INxa0MOLECULARBIOLOGY)(F.M.Ausubel,等.编辑,(2003));酶学方法(Methodsxa0INENZYMOLOGY)系列(学术出版社公司):PCRxa02:实用方法(PCRxa02:APRACTICALxa0APPROACH)(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995)),Harlow和Lane,编辑(1988)抗体,实验室手册,和动物细胞培养(ANTIBODIES,Axa0LABORATORYxa0MANUAL,andxa0ANIMALxa0CELLCULTURE)(R.I.Freshney,编辑(1987))。定义“分离的”抗体指已经鉴定且与其天然环境的成分分离和/或从其回收的抗体。抗体的天然环境的污染性成分是将会干扰其诊断或治疗用途的物质,并且可包括酶、激素、和其它蛋白质性或非蛋白质性的溶质。在优选实施方案中,将抗体纯化至(1)通过例如Lowry法确定,超过95重量%的抗体,并且最优选超过99重量%的抗体,(2)足以通过使用转杯式测序仪(spinningxa0cupxa0sequenator)获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度,或(3)通过使用例如考马斯蓝或优选银染色,在还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳),达到同质。既然抗体的天然环境的至少一种成分不会存在,那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而,分离的抗体通常通过至少一个纯化步骤来制备。“分离的”核酸分子是这样的核酸分子,其被鉴定并与至少一种污染性核酸分子分离,其与所述至少一种污染性核酸分子通常在所述核酸的天然来源中缔合。分离的核酸分子不同于其在自然界中被发现时的形式或环境。因此,分离的核酸分子不同于存在于天然细胞中的核酸分子。然而,分离的核酸分子包括包含在通常表达核酸分子的细胞中的核酸分子(例如,编码抗体的核酸),其中,例如,所述核酸分子存在的染色体位置与天然细胞的染色体位置不同。术语“依照Kabat的可变结构域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方式”及其变化形式指Kabat等,Sequencesxa0ofxa0Proteinsxa0ofImmunologicalxa0Interest(免疫学感兴趣的蛋白的序列),第5版,PublicHealthxa0Service,Nationalxa0Institutesxa0ofxa0Health,Bethesda,MD.(1991)中的用于抗体编制的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用此编号系统,实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸,对应于可变结构域FR或CDR的缩短或插入。例如,重链可变结构域可包含H2的残基52后的单一氨基酸插入物(依照Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的多个插入残基(例如依照Kabat为残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源区进行比对来确定。术语“基本相似”或“基本不同,”用于本文时,是指在两个数值(通常一个与本发明的抗体相关,而另一个与参照/比较抗体相关)之间的足够高程度的相似性,从而使本领域技术人员认为在通过所述值(例如,Kd值)测量的生物学特征的背景下,在两个值之间的差异是具有很少或没有生物学和/或统计学显著性的。在所述两个值之间的差异作为参照/比较抗体的值的函数优选小于约50%,优选小于约40%,优选小于约30%,优选小于约20%,和/或优选小于约10%。“结合亲合力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明,在用于本文时,“结合亲合力”指反映结合对(例如抗体与抗原)的成员之间1∶1相互作用的固有结合亲合力。分子X对其配偶体Y的亲合力通常可用解离常数(Kd)来表述。合乎需要的是Kd为1x10^-7,1x10^-8,5x10^-8,1x10^-9,3x10^-9,5x10^-9,或甚至1x10^-10或更强。亲合力可通过本领域知道的常用方法来测量,包括本文中所描述的那些方法。低亲合力抗体通常缓慢的结合抗原且趋于容易解离,而高亲合力抗体通常更快速的结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲合力的多种方法,其中任一种都可用于本发明的目的。具体说明型实施方案在下文中描述。在一个实施方案中,根据本发明的“Kd”或“Kd值”通过如在下面测定法中所述用目的抗体的Fab形式和其抗原进行的放射性标记的抗原结合测定法(RIA)测量:所述测定法测量Fabs对抗原的溶液结合亲合力,这通过在存在滴定系列的未标记抗原时,用最小浓度的(¹²⁵I)-标记的抗原来平衡Fab,接着用抗-Fab抗体-包被的板捕获结合的抗原来进行(Chen,等,(1999)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)293:865-881)。为了确定测定的条件,将微量滴定板(Dynex)用5μg/ml的在50mM碳酸钠(pHxa09.6)中的捕获抗-Fab抗体(Cappelxa0Labs)包被过夜,并随后用PBS中的2%(w/v)牛血清白蛋白在室温(约23°C)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中,将100pM或26pM[¹²⁵I]-抗原与目的Fab的系列稀释物混合(例如,与在Presta等,(1997)癌症研究(Cancerxa0Res).57:4593-4599中的抗-VEGF抗体,Fab-12的评价一致)。接着,将目的Fab温育过夜;然而温育可以持续更长的阶段(例如65小时)从而确保达到平衡。随后,将混合物转移到捕获板中来在室温进行温育(例如,1小时)。接着,去除溶液,并将所述板用在PBS中的0.1%吐温-20洗涤8次。当所述板已经干燥时,加入150μl/孔的闪烁剂(MicroScint-20;Packard),并将所述板在Topcountγ计数器(Packard)上计数10分钟。选择提供少于或等于20%的最大结合的每种Fab的浓度用在竞争性结合测定法中。根据另一个实施方案,Kd或Kd值是通过使用表面等离振子共振测定法使用BIAcore^TM-2000或BIAcore^TM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25°C使用固定化抗原CM5芯片以约10个响应单位(RU)测量的。简言之,依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidexa0hydrochloride)(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIAcorexa0Inc.)。用10mM乙酸钠pH4.8将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM),然后以5μl/分钟的流速注入以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后,注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。为了进行动力学测量,将Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)在25°C以约25μl/分钟的流速注入在含0.05%吐温20的PBS(PBST)中。在一些实施方案中,下列的改进用于表面等离振子共振测定法:将抗体固定在CM5生物传感器芯片以达到大约400RU,并用于动力学测量,靶蛋白(例如,FGFR3-IIIb或-IIIc)的两倍系列稀释液(从67nM开始)在25°C以约30ul/分钟的流速注入至PBST缓冲液中。使用简单一对一朗格缪尔结合模型(one-to-oneLangmuirxa0bindingxa0model)(BIAcore评价软件3.2版(BIAcorexa0evaluationSoftwarexa0versionxa03.2))通过同时拟合缔合和解离传感图来计算缔合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)以比率k_off/k_on计算。参见例如Chen等,(1999)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)293:865-881。如果根据上文表面等离振子共振测定法,缔合速率(on-rate)超过10⁶M^-1S^-1,则缔合速率可使用荧光淬灭技术来测定,即如在分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Avivxa0Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯(stirredxa0cuvette)测量,在存在渐增浓度的抗原的条件下,测量PBS,pHxa07.2中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)在25°C的荧光发射强度(激发=295nm;发射=340nm,16nm通带)的升高或降低。根据本发明的“缔合速率”(on-rate,或ratexa0ofxa0association,或associationxa0rate)或“k_on”也可使用BIAcore^TM-2000或BIAcore^TM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)采用上述相同的表面等离振子共振技术,在25°C利用固定的抗原CM5芯片以约10个响应单位(RU)来测定。简言之,依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,BIAcorexa0Inc.)。用10mM乙酸钠pH4.8将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM),然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后,注入1M乙醇胺以封闭未反应的基团。为了进行动力学测量,在25°C以约25μl/分钟的流速在含0.05%吐温20的PBS(PBST)中注入Fab(0.78nM至500nM)的两倍连续稀释液。在一些实施方案中,下列的改进用于表面等离振子共振测定法:将抗体固定在CM5生物传感器芯片以达到大约400RU,并对于动力学测量,靶蛋白(例如,FGFR3-IIIb或-IIIc)的两倍连续稀释液(从67nM开始)在25°C以约30ul/分钟的流速注入至PBST缓冲液中。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcorexa0evaluationxa0Softwarexa0versionxa03.2)通过同时拟合缔合和解离S型曲线计算缔合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)以比率k_off/k_on计算。参见例如Chen,Y.等,(1999)J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)293:865-881。然而,如果根据上文表面等离振子共振测定法,缔合速率超过10⁶M^-1S^-1,那么缔合速率优选地使用荧光淬灭技术来测定,即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(stop-flowxa0equippedspectrophometer)(Avivxa0Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量,在存在浓度渐增的抗原的条件下,测量PBS,pHxa07.2中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)在25°C的荧光发射强度(激发=295nm;发射=340nm,16nm带通)的升高或降低。当用于本文时,术语“载体”意在指能够运送已经与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”,其指环状双链DNA环,另外的DNA区段可以连接在该环状双链DNA环中。另一种类型的载体是噬菌体载体。另一种类型的载体是病毒载体,其中另外的DNA区段可以连接至病毒基因组中。某些载体能够在已经引入它们的宿主细胞中自主复制(例如,具有细菌复制起始点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如,非附加型哺乳动物载体)在引入至宿主细胞中时可以整合至宿主细胞的基因组中,并且因此它们与宿主基因组一起复制。此外,某些载体能够指导与它们可操作地连接的基因的表达。这样的载体在本文中称为“重组表达载体”(或简单地,“重组载体”)。通常,用于重组DNA技术中的表达载体经常是质粒的形式。在本说明书中,“质粒”和“载体”可以互换使用,因为质粒是最普遍使用的载体形式。“多核苷酸”或“核酸”当在本文中可互换使用时,是指任意长度的核苷酸的聚合物,包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或可以通过DNA或RNA聚合酶、或通过合成反应掺入至聚合物中的任何基质。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸,诸如甲基化的核苷酸和它们的类似物。如果存在,可以在所述聚合物组装之前或之后施加对核苷酸结构的修饰作用。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分中断。多核苷酸可以在合成后进一步被修饰,诸如通过与标记物缀合。其他类型的修饰作用包括,例如,“帽(caps)”,一个或多个天然存在的核苷酸被类似物的置换,核苷酸间修饰诸如,例如,具有不带电荷的键的那些(例如,膦酸甲酯,膦酸三酯,氨基磷酸酯(phosphoamidates),氨基甲酸酯,等)和具有带电荷键的那些(例如,硫代磷酸酯,二硫代磷酸酯,等),包含侧基结构部分的那些,诸如,例如,蛋白质(例如,核酸酶,毒素,抗体,信号肽,聚-L-赖氨酸,等),具有嵌入剂的那些(例如,吖啶,补骨脂素(psoralen),等),包含螯合剂的那些(例如,金属,放射性金属,硼,氧化性金属,等),包含烷化剂的那些,具有修饰的键的那些(例如,α异头核酸,等),以及一种或多种未修饰形式的多核苷酸。此外,通常存在于糖中的任一个羟基可以被例如膦酸酯基团、磷酸酯基团置换,被标准的保护基团保护,或被活化以制备与另外的核苷酸连接的另外的键,或可以与固体或半固体的支持体缀合。5’和3’末端OH可以被磷酸化或被胺或1-20个碳原子的有机封端基团结构部分取代。其他羟基也可以被衍生为标准的保护基团。多核苷酸也可以包含本领域中普遍已知的核糖或脱氧核糖糖类的类似形式,包括,例如,2’-O-甲基-,2’-O-烯丙基,2’-氟-或2’-叠氮基-核糖,碳环糖类似物,α-异头糖,差向异构糖诸如阿拉伯糖,木糖或来苏糖,吡喃糖,呋喃糖,景天庚酮糖(sedoheptulose),无环类似物和碱性核苷类似物诸如甲基核糖核苷。一个或多个磷酸二酯键可以被可选的连接基团置换。这些可选的连接基团包括,但不限于,其中磷酸酯被P(O)S(“硫代酯(thioate)”),P(S)S(“二硫代酯(dithioate)”),(O)NR₂(“酰胺化物”),P(O)R,P(O)OR’,CO或CH₂(“甲缩醛(formacetal)”)置换的实施方案,其中每个R或R’独立地是H或取代的或未取代的烷基(1-20C),任选地包含醚(-O-)键,芳基,烯基,环烷基,环烯基或araldyl。多核苷酸中的所有键没有必要是相同的。前面的描述适用于本文提及的所有多核苷酸,包括RNA和DNA。“寡核苷酸,”当用于本文中时,通常是指短的、-般是单链的、-般是合成的多核苷酸,其通常,但非必要地,长度小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”不互斥。上面对于多核苷酸的描述同样和完全地适用于寡核苷酸。关于肽或多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同-性”,定义为将候选序列与具体肽或多肽序列在进行序列比对(并在必要时导入空隙)以获取最大百分比序列同-性,且不将任何保守置换视为序列同-性的部分之后,候选序列中的氨基酸残基与所述具体肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的百分数。可使用本领域技术内的各种方法进行序列比对以便测定氨基酸序列同-性百分比,例如,使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数,包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。然而,为此目的,氨基酸序列同-性%值使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生,其中用于ALIGN-2程序的全部源代码在下面的表A中提供。ALIGN-2序列比对计算机程序的作者是Genentech,Inc.,该源代码已经随用户文档提交至美国版权局(Washingtonxa0D.C.,20559),其美国版权注册登记号为TXU510087。公众可通过Genentech,Inc.(Southxa0SanFrancisco,加利福尼亚)得到ALIGN-2程序,或者可以从例如WO2007/001851中提供的源代码进行编译。ALIGN-2程序应当为在UNIX操作系统,优选在数字UNIXxa0V4.0D上使用而进行编译。ALIGN-2程序设定了所有序列比对参数并且不变。在ALIGN-2应用于氨基酸序列比较的情况中,给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的氨基酸序列同-性%(或者这样说:给定氨基酸序列A具有或含有相对于、与或针对给定氨基酸序列B的某-%氨基酸序列同-性)如下计算:X/Y比值乘以100,其中X是用序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数,且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以理解,当氨基酸序列A与氨基酸序列B的长度不相等时,A相对于B的氨基酸序列同-性%将不等于B相对于A的氨基酸序列同-性%。在-些实施方案中,两个或多个氨基酸序列至少50%,60%,70%,80%,或90%相同。在-些实施方案中,两个或多个氨基酸序列至少95%,97%,98%,99%,或甚至100%相同。除非另外特别指出,使用ALIGN-2计算机程序如在紧接的前面段落中所述获得在本文中所用的所有的%氨基酸序列同-性的值。术语“FGFR3,”当在本文中使用时,除非具体或另外根据上下文指示,是指任何天然或变体(不论天然或合成的)FGFR3多肽(例如,FGFR3-IIIb同种型或FGFR3-IIIc同种型)。术语“天然序列”具体包涵天然存在的截短形式(例如,细胞外结构域序列或跨膜亚基序列),天然存在的变体形式(例如,选择性拼接形式)和天然存在的等位基因变体。术语“野生型FGFR3”通常是指包含天然存在的FGFR3蛋白的氨基酸序列的多肽。术语“野生型FGFR3序列”通常是指存在于天然存在的FGFR3中的氨基酸序列。术语“FGFR3配体,”(可互换地称为“FGF”)当在本文中使用时,除非具体或另外根据上下文指示,是指任何天然或变体(不论天然或合成的)FGFR3配体(例如,FGF1,FGF2,FGF4,FGF8,FGF9,FGF17,FGF18,FGF23)多肽。术语“天然序列”具体地包涵天然存在的截短形式(例如,细胞外结构域序列或跨膜亚基序列),天然存在的变体形式(例如,选择性拼接形式)和天然存在的等位基因变体。术语“野生型FGFR3配体”通常是指包含天然存在的FGFR3配体蛋白的氨基酸序列的多肽。术语“野生型FGFR3配体序列”通常是指存在于天然存在的FGFR3配体中的氨基酸序列。“FGFR3激活”是指FGFR3受体的激活或磷酸化。一般而言,FGFR3激活导致信号转导(例如,由FGFR3受体的胞内激酶结构域磷酸化FGFR3或底物多肽中的酪氨酸残基所导致)。FGFR3激活可由FGFR配体结合目的FGFR3受体介导。结合FGFR3的FGFR3配体(例如,诸如FGF1或FGF9)可激活FGFR3的激酶结构域,从而导致FGFR3中的酪氨酸残基的磷酸化和/或另外的一种或多种底物多肽中的酪氨酸残基的磷酸化。术语“组成型”当用于本文中时,当例如应用于受体激酶活性时,是指受体的连续信号传导活性,该活性不依赖于配体或其他激活分子的存在。取决于受体的性质,所有活性可以是组成型的或受体的活性可以进一步被其他分子(例如,配体)的结合激活。导致受体的激活的细胞事件对于本领域普通技术人员是公知的。例如,激活可以包括低聚化(例如,二聚化,三聚化等)成为更高级的受体复合物。复合物可以包含单一的蛋白物种,即,均聚复合物(homomericxa0complex)。备选地,复合物可以包含至少两种不同的蛋白物种,即,异聚复合物(heteromericxa0complex)。复合物形成可以由例如,正常或突变体形式的受体在细胞表面上的过表达导致。复合物形成也可以由受体中一个或多个特定的突变导致。术语“配体-不依赖性”当用于本文中时,当例如应用于受体信号传导活性时,是指不依赖于配体的存在的信号传导活性。具有配体-不依赖性激酶活性的受体没有必要排除用于产生另外的激酶活性激活的配体与该受体的结合。术语“配体-依赖性”当用于本文中时,当例如应用于受体信号传导活性时,是指依赖于配体的存在的信号传导活性。短语′′基因扩增′′是指这样的过程,通过该过程在特定细胞或细胞系中形成多拷贝的基因或基因片段。被复制的区(一段扩增的DNA)常常被称为“扩增子”。通常,所产生的信使RNA(mRNA)的量,即基因表达的水平,也与被表达的该特定基因产生的拷贝数成比例地增加。′′酪氨酸激酶抑制剂′′是这样的分子,其在一些程度上抑制酪氨酸激酶如FGFR3受体的酪氨酸激酶活性。“显示FGFR3表达、扩增或激活”的癌症或生物学样品是在诊断检测中,表达(包括过表达)FGFR3,具有扩增的FGFR3基因,和/或以其他方式证明FGFR3的激活或磷酸化的癌症或生物学样品。′′显示FGFR3激活′′的癌症或生物学样品是在诊断测试中,证明FGFR3的激活或磷酸化的癌症或生物学样品。此类激活可直接确定(例如通过ELISA测量FGFR3磷酸化)或间接确定。′′显示FGFR3激活′′的癌症或生物学样品是在诊断检测中,表现出FGFR3的组成型激活或磷酸化的癌症或生物学样品。此类激活可直接确定(例如通过ELISA测量c-FGFR3磷酸化)或间接确定。′′显示FGFR3扩增′′的癌症或生物学样品是在诊断检测中具有扩增的FGFR3基因的癌症或生物学样品。′′显示FGFR3易位′′的癌症或生物学样品是在诊断检测中具有易位的FGFR3基因的癌症或生物学样品。FGFR3易位的实例是t(4;14)易位,其发生在一些多发性骨髓瘤肿瘤中。“磷酸-ELISA测定(phospho-ELISAxa0assay)”在本文中是其中在酶联免疫吸附测定法(ELISA)中评估一种或多种FGFR3、底物或下游信号传导分子的磷酸化的测定,该测定使用试剂,通常是抗体,检测磷酸化的FGFR3、底物或下游信号传导分子。在一些实施方案中,使用检测磷酸化的FGFR3或pMAPK的抗体。该测定可对细胞裂解物、优选来自新鲜的或冷冻的生物学样品的细胞裂解物进行。′′显示配体-不依赖性FGFR3激活′′的癌症或生物学样品是在诊断检测中,表现出FGFR3的配体-不依赖性激活或磷酸化的癌症或生物学样品。此类激活可直接确定(例如通过ELISA测量FGFR3磷酸化)或间接确定。′′显示配体-依赖性FGFR3激活′′的癌症或生物学样品是在诊断检测中,表现出FGFR3的配体-依赖性激活或磷酸化的癌症或生物学样品。此类激活可直接确定(例如通过ELISA测量FGFR3磷酸化)或间接确定。′′显示配体-不依赖性FGFR3激活′′的癌症或生物学样品是在诊断检测中,表现出FGFR3的配体-不依赖性激活或磷酸化的癌症或生物学样品。此类激活可直接确定(例如通过ELISA测量FGFR3磷酸化)或间接确定。具有“FGFR3过表达或扩增”的癌细胞指与同一组织类型的非癌细胞相比,具有显著更高的FGFR3蛋白质或基因水平的癌细胞。此类过表达可以是由基因扩增或者转录或翻译增加引起。可在诊断或预后测定中通过评估细胞表面上存在的增加的FGFR3蛋白质水平(例如通过免疫组化测定,IHC)来测定FGFR3的过表达或扩增。备选地,或另外地,可测量细胞中编码FGFR3的核酸的水平,例如通过荧光原位杂交(FISH;参见1998年10月公布的WO98/45479)、Southern印迹或聚合酶链式反应(PCR)技术,诸如定量实时PCR(qRT-PCR)。在上述测定法之外,熟练从业人员还可利用多种体内测定法。例如,可将患者体内细胞暴露于任选用可检测标记物例如放射性同位素标记的抗体,并且可评估该抗体与患者体内细胞的结合,例如通过外部扫描放射性或通过分析取自事先已暴露于所述抗体的患者的活组织检查。术语“突变”在本文中使用时指特定蛋白质或核酸(基因,RNA)分别相对于野生型蛋白质或核酸的氨基酸或核酸序列的差异。突变的蛋白质或核酸可以由基因的一个等位基因(杂合的)或两个等位基因(纯合的)表达或者在其中找到,而且它可以是体细胞的或种系的。在本发明中,突变一般是体细胞的。突变包括序列重排,诸如插入、缺失、和点突变(包括单核苷酸/氨基酸多态性)。“抑制”是与参照相比降低或减少活性、功能,和/或量。当一种药剂模拟目的多肽(例如,FGFR配体,诸如FGF1或FGF9)的至少一种功能性活性时,其具有“激动剂活性或功能”。“激动剂抗体”在本文中使用时是模拟目的多肽(例如,FGFR配体,诸如FGF1或FGF9)的至少一种功能性活性的抗体。蛋白质“表达”指基因中所编码的信息转换成信使RNA(mRNA),然后转换成蛋白质。在本文中,“表达”目的蛋白质(诸如FGF受体或FGF受体配体)的样品或细胞指这样的样品或细胞,在所述样品或细胞中确定存在有编码该蛋白质的mRNA,或蛋白质(包括其片段)。“免疫缀合物”(可互换地称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”),是指与一种或多种细胞毒性剂缀合的抗体,所述细胞毒性剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白毒素,细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素,或其片段)或放射性同位素(即放射缀合物)。术语“Fc区”用于本文时一般是指包含免疫球蛋白重链C末端的多肽序列的二聚体复合物,其中C末端多肽序列是可以通过木瓜蛋白酶消化完整抗体获得的序列。Fc区可以包括天然或变体Fc序列。虽然免疫球蛋白重链Fc序列的边界可以变化,但是人IgG重链Fc序列通常定义为Fc序列自大约Cys226位置或大约Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段。免疫球蛋白的Fc序列一般包含两个恒定结构域,即CH2结构域和CH3结构域,任选包含CH4结构域。Fc区的C-末端赖氨酸(依照EU编号系统的残基447)可以被移除,例如,在抗体的纯化期间或通过编码所述抗体的核酸的重组改造。因此,根据本发明包含具有Fc区的抗体的组合物可以包含具有K447的抗体、所有K447均被移除的抗体、或具有K447残基的抗体和没有K447残基的抗体的混合物。本文中“Fc多肽”的意思是构成Fc区的多肽之一。Fc多肽可从任何适当的免疫球蛋白(如IgG₁,IgG₂,IgG₃,或IgG₄亚型,IgA,IgE,IgD或IgM)获得。在一些实施方案中,Fc多肽包含部分或全部野生型铰链序列(一般在其N末端)。在一些实施方案中,Fc多肽不包含功能的或野生型铰链序列。“封闭”抗体或抗体“拮抗剂”是抑制或降低其结合的抗原的生物学活性的抗体。优选的封闭抗体或拮抗性抗体完全抑制抗原的生物学活性。“裸抗体(nakedxa0antibody)”是没有缀合异源分子(如细胞毒性结构部分或放射性标记)的抗体。具有指定抗体的“生物学特征”的抗体指具有该指定抗体区别于结合相同抗原的其它抗体的一项或多项生物学特征的抗体。为了筛选这样的抗体,其结合由目的抗体结合的抗原的表位,可以实施常规交叉阻断测定法,诸如抗体,实验室手册(Antibodies,Axa0Laboratoryxa0Manual),冷泉港实验室,Edxa0Harlow和Davidxa0Lane(1988)中所记载的。为增加包含本发明的氨基酸序列的抗体或多肽的半衰期,可将拯救受体(salvagexa0receptor)结合表位连接到抗体(尤其是抗体片段),如例如美国专利5,739,277所述。例如,可将编码拯救受体结合表位的核酸分子与编码本发明多肽序列的核酸符合阅读框地连接,从而使改造的核酸分子所表达的融合蛋白包含所述拯救受体结合表位和本发明的多肽序列。本文所用的术语“拯救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG₁,IgG₂,IgG₃,或IgG₄)的Fc区的表位,其负责增加IgG分子的体内血清半衰期(例如Ghetie等,Ann.Rev.Immunol.(免疫学年评)18:739-766(2000),表1)。在其Fc区具有取代并且血清半衰期增加的抗体也见于WO00/42072,WOxa002/060919;Shields等,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276:6591-6604(2001);Hinton,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)279:6213-6216(2004))的描述。在另一个实施方案中,例如通过连接其它多肽序列,也可以增加血清半衰期。例如,本发明的方法中有用的抗体或其它多肽可与血清白蛋白或血清白蛋白的结合FcRn受体的部分或血清白蛋白结合肽连接,从而使所述血清白蛋白结合所述抗体或多肽,例如这样的多肽序列见于WO01/45746的公开。在一个优选的实施方案中,所连接的血清白蛋白肽包含氨基酸序列DICLPRWGCLW(SEQIDxa0NO:183)。在另一个实施方案中,Fab的半衰期是通过这些方法增加的。血清白蛋白结合肽序列也见Dennis等,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)277:35035-35043(2002)。“片段”意指优选包含参照核酸分子或多肽的完整长度的至少10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%,或更多的多肽或核酸分子的部分。片段可以包含10,20,30,40,50,60,70,80,90,或100,200,300,400,500,600,或更多个核苷酸或10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,120,140,160,180,190,200个氨基酸或更多个氨基酸。关于本发明的抗体的短语“很少至没有激动剂功能”在本文中使用时是指例如,在施用于受试者时,所述抗体不引发有生物学意义的量的激动剂活性。如本领域中所理解的,活性的量可以定量地或定性地确定,只要在本发明的抗体和参照副本之间可以作出比较。所述活性可以根据本领域已知的任何测定或技术来测量或检测,包括,例如,本文所述的那些。本发明的抗体及其参照副本的活性的量可以平行地确定或在单独的运行中确定。在一些实施方案中,本发明的二价抗体不具有实质的激动剂功能。术语“凋亡”和“凋亡活性”以广义使用,并且是指哺乳动物中细胞死亡的有秩序或可控形式,其典型地伴有一种或多种特征性细胞改变,包括细胞质的凝聚,质膜微绒毛的损失,细胞核的分裂(segmentation),染色体DNA的降解或线粒体功能的丧失。此活性可以使用本领域中已知的技术确定和测量,例如,通过细胞活力测定,FACS分析或DNA电泳,和更具体地通过膜联蛋白V(annexinxa0V)的结合,DNA的片段化,细胞收缩,内质网的扩张,细胞片段化,和/或膜囊泡的形成(称为凋亡小体)确定和测量。术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广义可互换使用,并且包括单克隆抗体(例如,全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体,只要它们显示所需的生物学活性),并且还可以包括某些抗体片段(如本文中更详细地描述的那样)。抗体可以是人的、人源化的和/或亲和力成熟的。术语“可变的”指可变结构域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的事实。然而,变异性并非均匀分布于抗体的整个可变结构域。它集中于轻链和重链可变结构域中称作互补性决定区(CDRS)或高变区的三个区段。可变结构域中更加高度保守的部分被称作构架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区,它们大多采取β-折叠构象,通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构一部分的三个CDRs连接。每条链中的CDRs通过FR区非常接近的保持在一起,并与另一条链的CDRs一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等,免疫学感兴趣的蛋白的序列(Sequencesxa0ofxa0Proteinsxa0ofxa0Immunologicalxa0Interest),第5版,国立卫生研究所(Nationalxa0Institutexa0ofxa0Health),Bethesda,MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合,但展现出多种效应子功能,诸如抗体在抗体依赖性细胞毒性中的参与。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段,称为“Fab”片段,所述“Fab”片段每个具有单抗原结合位点,并且产生残余的“Fc”片段,其名称反映其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab’)₂片段,所述片段具有两个抗原组合位点,并且仍旧能够交联抗原。“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv种类中,此区由一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域以紧密的、非共价缔合的二聚体组成。在单链Fv种类中,一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接从而使轻链和重链可以以类似于双链Fv种类的“二聚体”结构缔合。在这种构型中,每个可变结构域的三个CDRs相互作用从而限定在VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。总而言之,六个CDRs将抗原结合特异性赋予抗体。然而,即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个CDRs的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力,然而亲和性低于完整结合位点。Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基端加入几个残基,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文关于Fab’的名称,其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基。F(ab’)₂抗体片段最初作为在它们之间具有铰链半胱氨酸的Fab’片段对产生。还已知抗体片段的其它化学偶联。基于抗体(免疫球蛋白)的恒定结构域的氨基酸序列,可以将来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”分为两种清楚区分的类型之一,称为kappa(κ)和lambda(λ)。取决于免疫球蛋白的重链的恒定结构域的氨基酸序列,可以将免疫球蛋白分为不同的种类。存在五种主要的免疫球蛋白类别:IgA,IgD,IgE,IgG,和IgM,并且这些中的一些可以进一步分为亚类(同种型),例如IgG₁,IgG₂,IgG₃,IgG₄,IgA₁,和IgA₂。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α,δ,ε,γ,和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。“抗体片段”仅包含完整抗体的一部分,其中所述部分优选地保留与该部分存在于完整抗体中时正常相关的至少一种、优选大多数或全部功能。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段;双抗体;线性抗体;单链抗体分子;和由抗体片段形成的多特异性抗体。在一个实施方案中,抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点,并且因此保留了结合抗原的能力。在另一个实施方案中,抗体片段,例如包含Fc区的抗体片段保留了与Fc区存在于完整抗体中时正常相关的至少一种生物学功能,诸如FcRn结合,抗体半衰期调节,ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中,抗体片段是单价抗体,其在体内的半衰期基本上类似于完整的抗体。例如,这样的抗体片段可以在与Fc连接的抗原结合臂上包含能够赋予该片段以体内稳定性的序列。术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变结构域中序列上高度可变和/或形成结构上限定的环的区域。通常,抗体包含六个高变区:三个在VH中(H1、H2、H3),三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中使用且涵盖许多高变区的叙述。Kabat互补性决定区(CDR)是以序列变异性为基础的,而且是最常用的(Kabat等,免疫学感兴趣的蛋白的序列(Sequencesxa0ofxa0Proteinsxa0ofxa0Immunologicalxa0Interest),第5版.公众健康服务(Publicxa0Healthxa0Service),国立卫生研究所(Nationalxa0Institutesxa0ofxa0Health),Bethesda,MD.(1991))。相反,Chothia指结构环的位置(Chothia和Lesk,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196:901-917(1987))。AbM高变区代表Kabatxa0CDRs与Chothia结构环之间的折衷,而且由Oxfordxa0Molecular的AbM抗体建模软件使用。“接触(contact)”高变区是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些高变区中每一个的残基。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>高变区可包括如下的“延伸的高变区”:VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97(L3)及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个,可变结构域残基是依照Kabat等,见上文编号的。“构架”或“FR”残基指除本文中所定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是包含衍生自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合抗体。对于大多数部分,人源化抗体是人免疫球蛋白(接受体抗体),其中接受体的高变区残基用具有期望特异性、亲和性和/或能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高变区残基替换。在有些情况中,将人免疫球蛋白的构架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外,人源化抗体可包含在接受体抗体中或在供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言,所述人源化抗体将包含基本上全部的至少一个、典型地两个可变结构域,其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环,且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc),典型地是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等,自然(Nature)321:522-525(1986);Riechmann等,自然(Nature)332:323-329(1988);及Presta,现代结构生物学观点(Curr.Op.Struct.Biol.)2:593-596(1992)。还参见下面的综述文章和其中引用的参考文献:Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthmaxa0&xa0Immunol.(变态反应、哮喘和免疫学年报)1:105-115(1998);Harris,Biochem.Soc.Transactions(生物化学会会刊)23:1035-1038(1995);Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.(生物技术现代评论)5:428-433(1994)。“嵌合”抗体(免疫球蛋白)具有与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源的一部分重链和/或轻链(而一条或多条链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源),以及此类抗体的片段,只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利号4,816,567和Morrison等,美国国家科学院学报(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)81:6851-6855(1984))。人源化抗体当在本文中使用时是嵌合抗体的亚组。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域,其中这些结构域以单多肽链存在。一般地,所述scFv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头,所述接头使scFv形成对于抗原结合需要的结构。关于scFv的综述参见例如Pluckthun于Thexa0Pharmacologyxa0ofxa0MonoclonalAntibodies(单克隆抗体药理学),卷113,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,Newxa0York,pp.269-315(1994)中。“抗原”是抗体可以选择性结合的预定抗原。靶抗原可以是多肽,碳水化合物,核酸,半抗原或其他天然存在的或合成的化合物。优选地,靶抗原是多肽。术语“双抗体(diabodies)”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段,所述片段在相同的多肽链(VH-VL)中包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短所以不能在相同链上的两个结构域之间配对的接头,迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对从而产生两个抗原结合位点。双抗体更充分地描述于例如EPxa0404,097;WOxa093/11161;和Hollinger等,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:6444-6448(1993)中。“人抗体”指这样的抗体,其具有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术产生。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个CDRs中具有一处或多处改变的抗体,所述改变导致该抗体对抗原的亲和性与没有这些改变的亲本抗体相比有所提高。优选的亲和力成熟的抗体将具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和性。亲和力成熟的抗体通过一些本领域已知方法来生成。Marks等,生物/技术(Bio/Technology)10:779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和性成熟。以下文献记载了CDR和/或构架残基的随机诱变:Barbas等,美国国家科学院学报(Procxa0Nat.Acad.Sci,USA)91:3809-3813(1994);Schier等,基因(Gene)169:147-155(1995);Yelton等,免疫学杂志(J.Immunol.)155:1994-2004(1995);Jackson等,免疫学杂志(J.Immunol.)154(7):3310-9(1995);及Hawkins等,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)226:889-896(1992)。抗体“效应子功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应子功能的实例包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性;Fc受体结合;抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用;细胞表面受体(例如B细胞受体)下调;和B细胞活化。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞,随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。抗体“武装”细胞毒性细胞并且对于这种杀伤是绝对必需的。介导ADCC的主要细胞即NK细胞只表达FcγRIII,而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,免疫学年评(Annu.Rev.Immunol.)9:457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性,可进行体外ADCC测定法,诸如美国专利号5,500,362或5,821,337或Presta美国专利号6,737,056中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或另外地,可在体内评估目的分子的ADCC活性,例如在动物模型中,诸如Clynes等,PNAS(USA)95:652-656(1998)中所公开的。“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应子功能的白细胞。优选该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞,优选PBMCs和NK细胞。效应细胞可以从天然来源(例如从血液)分离。“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。优选FcR是天然序列人FcR。此外,优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体),包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体,包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”),它们具有相似的氨基酸序列,区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见,ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="186"/>,免疫学年评(Annu.Rev.Immunol.)15:203-234(1997)中的综述)。FcR的综述参见Ravetch和Kinet,免疫学年评(Annu.Rev.Immunol.)9:457-92(1991);Capel等,免疫方法(Immunomethods)4:25-34(1994);及dexa0Haas等,实验室临床医学杂志(J.Lab.Clin.Med.)126:330-41(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR,包括未来将会鉴定的那些。该术语还包括新生儿受体,FcRn,它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer等,免疫学杂志(J.Immunol.)117:587(1976)和Kim等,免疫学杂志(J.Immunol.)24:249(1994))并调节免疫球蛋白的体内稳态。WO00/42072(Presta)描述了与FcRs的结合改善或减少的抗体变体。该专利公开的内容具体地通过引用合并于本文中。还参见,Shields等,J.Biol.Chem.(生物化学杂志)9(2):6591-6604(2001)。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见,例如,Ghetiexa01997,Hinton2004)。可测定人FcRn高亲和性结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期,例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染的人细胞系中,或者在施用抑Fc变体多肽的灵长类动物中。“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的裂解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)结合(适宜亚类的)抗体起始的,该抗体已结合至其关联抗原。为了评估补体激活,可进行CDC测定法,例如如Gazzano-Santoro等,免疫方法杂志(J.Immunol.Methods)202:163(1996)中所记载的。具有改变的Fc区氨基酸序列及提高或降低的C1q结合能力的多肽变体记载于例如美国专利号6,194,551B1和WOxa099/51642。那些专利公开的内容具体地通过引用合并于本文中。还可参见Idusogie等,免疫学杂志(J.Immunol.)164:4178-4184(2000)。术语“包含Fc区的多肽”是指包含Fc区的多肽,诸如抗体或免疫粘附素。例如,在抗体纯化过程中或通过重组改造编码所述多肽的核酸,可以去除Fc区的C-末端赖氨酸(依照EU编号系统的残基447)。因此,根据本发明的包含具有Fc区的多肽的组合物可以包含具有K447的多肽,所有K447均被去除的多肽,或具有和不具有K447残基的多肽的混合物。用于本文目的的“接纳体人构架”是包含衍生自人免疫球蛋白构架,或衍生自人共有构架的VL或VH构架的氨基酸序列的构架。“衍生自”人免疫球蛋白构架或人共有构架的接纳体人构架可以包含其相同的氨基酸序列,或其可以包含预先存在的氨基酸序列的变化。当存在预先存在的氨基酸变化时,优选存在不多于5个和优选4个以下,或3个以下的预先存在的氨基酸变化。如果在VH中存在预先存在的氨基酸变化,优选地那些变化仅在位置71H,73H,和78H中的三个、两个或一个位置处;例如,在那些位置的氨基酸残基可以是71A,73T,和/或78A。在一个实施方案中,VL接纳体人构架的序列与VL人免疫球蛋白构架序列或人共有构架序列相同。“人共有构架”是在人免疫球蛋白VL或VH构架序列的选择中代表最常见的氨基酸残基的构架。一般地,人免疫球蛋白VL或VH序列的选择物来自可变结构域序列的亚组。一般地,序列的亚组是在Kabat等中的亚组。在一个实施方案中,关于VL,亚组是如在Kabat等中的亚组κI。在一个实施方案中,关于VH,亚组是如在Kabat等中的亚组III。“VH亚组III共有构架”包含获自在Kabat等的可变重链亚组III中的氨基酸序列的共有序列。在一个实施方案中,VH亚组III共有构架氨基酸序列包含下列序列的每个的至少一部分或全部:EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQxa0IDxa0NO:184)-HI-WVRQAPGKGLEWV(SEQxa0IDxa0NO:185)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQxa0IDxa0NO:186)-H3-WGQGTLVTVSS(SEQxa0IDxa0NO:187)“VL亚组I共有构架”包含获自在Kabat等的可变轻链κ亚组I的氨基酸序列的共有序列。在一个实施方案中,VH亚组I共有构架氨基酸序列包含下列序列的每个的至少一部分或全部:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTC(SEQxa0IDxa0NO:188)-LI-WYQQKPGKAPKLLIY(SEQxa0IDxa0NO:189)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQxa0IDxa0NO:190)-L3-FGQGTKVEIK(SEQxa0IDxa0NO:191)当用于本文时,“抗体突变体”或“抗体变体”指抗体的氨基酸序列变体,其中所述物种依赖型抗体的一个或多个氨基酸残基已被修饰。所述突变体必须与所述物种依赖型抗体具有小于100%的序列同一性或相似性。在一个实施方案中,所述抗体突变体与所述物种依赖型抗体的重链可变结构域或轻链可变结构域任一个的氨基酸序列具有至少75%的氨基酸序列同一性或相似性,更优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、且最优选至少95%的氨基酸序列同一性或相似性。关于这一序列的同一性或相似性在本文中定义为在比对序列且在需要时引入缺口(以获得最大百分比的序列同一性)后,候选序列中与物种依赖型抗体残基相同(即,相同残基)或相似(即,基于共有侧链特性,来自于同一组的氨基酸残基,见下)的氨基酸残基的百分比。在可变结构域外抗体序列中的N端、C端、或内部延伸、缺失或插入无一应该被解释为影响序列的同一性或相似性。“病症(disorder)”或“疾病(disease)”是将从用本发明的物质/分子或方法进行治疗获益的任何病况。这包括慢性和急性病症或疾病,包括使所述哺乳动物易感目的病症的病理性状况的那些。在本文中要治疗的病症的非限制性实例包括恶性和良性肿瘤;癌症,母细胞瘤和肉瘤。“治疗”是指治疗性处理和预防性或预防措施。需要治疗的那些包括已经患有良性、癌前的(pre-cancerous)或非转移性肿瘤的那些以及其中要预防癌症的发生或复发的那些。术语“治疗有效量”是指在哺乳动物中治疗剂治疗或预防疾病或病症的量。在癌症的情况下,治疗剂的治疗有效量可减少癌细胞的数量;减小原发性肿瘤大小;抑制(即减慢到一定程度并优选停止)癌细胞浸润到周围器官中;抑制(即减慢到一定程度并优选停止)肿瘤转移;在一定程度抑制肿瘤生长;和/或在一定程度上缓解一或多种与病症相关的症状。在达到药物可以预防现存癌细胞生长和/或杀死现存癌细胞的程度时,其可为细胞生长抑制性和/或细胞毒性的。对于癌症治疗,体内效力可以通过,例如评价存活时间、疾病进展时间(TTP)、反应率(RR)、反应持续时间、和/或生活质量来测量。术语“癌症”和“癌性”是指或者描述哺乳动物中典型地特征在于不可调控的细胞生长的生理学状态。包含于这种定义中的是良性和恶性癌症。“早期癌症”或“早期肿瘤”是指没有侵袭或转移的癌症或被分类为0、I或II期癌症的癌症。癌症的例子包括,但不限于,癌(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤(包括髓母细胞瘤(medulloblastoma)和视网膜母细胞瘤(retinoblastoma))、肉瘤(包括脂肪肉瘤(liposarcoma)和滑膜细胞肉瘤(synovialxa0cellxa0sarcoma)),神经内分泌肿瘤(neuroendocrinexa0tumors)(包括类癌瘤(carcinoidxa0tumors),胃泌素瘤(gastrinoma),和胰岛细胞癌(isletxa0cellcancer)),间皮瘤(mesothelioma),神经鞘瘤(schwannoma)(包括听神经瘤(acousticxa0neuroma)),脑膜瘤(meningioma),腺癌(adenocarcinoma),黑色素瘤(melanoma),和白血病或淋巴恶性肿瘤(lymphoidxa0malignancies)。这类癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌(例如,上皮鳞状细胞癌),肺癌,包括小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌和肺鳞状癌,腹膜癌,肝细胞癌,胃的或胃癌(gastricxa0orxa0stomachxa0cancer),包括胃肠癌(gastrointestinalxa0cancer),胰腺癌,成胶质细胞瘤(glioblastoma),子宫颈癌,卵巢癌,肝癌,膀胱癌,肝细胞瘤(hepatoma),乳腺癌(包括转移性乳腺癌),结肠癌,直肠癌,结肠直肠癌,子宫内膜或子宫癌,唾液腺癌,肾癌(kidneyorxa0renalxa0cancer),前列腺癌,外阴癌,甲状腺癌,肝癌,肛门癌,阴茎癌,睾丸癌,食管癌,胆道肿瘤,以及头颈部癌症和多发性骨髓瘤。术语“癌前的”是指典型地在癌症之前或发展成为癌症的状态或生长。“癌前的”生长具有以异常的细胞周期调控、增殖或分化为特征的细胞,其可以通过细胞周期调控、细胞增殖或分化的标志物来确定。“发育异常(dysplasia)”是指组织、器官或细胞的任何异常生长或发育。优选发育异常是高分级的或癌前的。“转移”意指癌症由其初始部位向身体的其它位置扩散。癌细胞可以脱离原代肿瘤,渗透到淋巴和血管中,通过血流循环,并且在身体中其它位置的正常组织中的远端病灶中生长(转移)。转移可以是局部的或远端的。转移是一个序贯的过程,在脱离原代肿瘤的肿瘤细胞上偶然发生,通过血流移行,并且在远端部位停止。在新的部位,细胞建立血液供应,并且可以生长形成威胁生命的团块(mass)。肿瘤细胞内的刺激性和抑制性分子途径调控这一行为,并且在远端部位中肿瘤细胞和宿主细胞之间的相互作用也是重要的。“非转移性”是指良性的癌症或保持在原发部位中并且没有渗透至淋巴或血管系统中或没有渗透至原发部位以外的组织中的癌症。通常,非转移性癌症是为0、I或II期癌症的任一种癌症,并且偶尔是III期癌症。“原发肿瘤”或“原发癌症”是指初始的癌症并且不是位于该受试者体内另一组织、器官或位置中的转移病灶。“良性肿瘤”或“良性癌症”是指仍然位于起源部位并且不具有浸润、侵袭或转移至远端部位的能力的肿瘤。“肿瘤负荷(tumorxa0burden)”是指机体内癌细胞的数目、肿瘤的大小或癌的量。肿瘤负荷也称为肿瘤负荷量(tumorxa0load)。“肿瘤数”是至肿瘤的数目。“受试者”意指哺乳动物,包括但不限于,人或非人哺乳动物,诸如牛、马、犬、羊或猫。优选地,所述受试者是人。术语“抗癌治疗”是指有效用于治疗癌症的治疗。抗癌治疗剂的实例包括,但不限于,例如,化疗剂、生长抑制剂、细胞毒性试剂、放射性治疗中所有的试剂、抗血管发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和其它治疗癌症的试剂、抗-CD20抗体、血小板衍生生长因子抑制剂(例如,Gleevec^TM甲磺酸伊马替尼(Imatinibxa0Mesylate)),COX-2抑制剂(例如,塞来考昔(celecoxib)),干扰素,细胞因子,结合下述一种或多种靶标的拮抗剂(例如,中和抗体):ErbB2,ErbB3,ErbB4,PDGFR-β,BlyS,APRIL,BCMA或VEGF受体,TRAIL/Apo2,和其它生物活性和有机化学剂等。它们的组合也包含在本发明中。术语“细胞毒性剂”用在本发明中指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意欲包括放射性同位素(例如L¹³¹,L¹²⁵,Y⁹⁰和Re¹⁸⁶),化疗剂,和毒素如细菌、真菌、植物或动物来源的酶学活性毒素,或其片段。“化疗剂”是有效用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括有效用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括烷化剂类(alkylatingxa0agents),如塞替哌(thiotepa)和ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="326"/>环磷酰胺(cyclosphosphamide);烷基磺酸酯(alkylxa0sulfonates)如白消安(busulfan),英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);吖丙啶类(aziridines)如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa);乙烯亚胺(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines),包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine);多聚乙酰类(acetogenins)(特别是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));喜树碱(camptothecin)(包括合成的类似物托泊替康(topotecan));苔藓抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物);隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8);多拉司他汀(dolastatin);倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成的类似物、KW-2189和CB1-TM1);艾榴素(eleutherobin);pancratistatin;匍枝珊瑚醇(sarcodictyin);海绵素(spongistatin);氮芥(nitrogenxa0mustards)如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethaminexa0oxidexa0hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracilxa0mustard);亚硝脲类(nitrosureas)如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine);抗生素类,如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如,加利车霉素(calicheamicin)、特别是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见,例如,Agnew,Chemxa0Intl.Ed.Engl.,33:183-186(1994));烯二炔蒽环类抗生素(dynemicin),包括烯二炔蒽环类抗生素A(dynemicinxa0A);二膦酸盐类(diphosphonates),如氯膦酸盐(clodronate);埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="422"/>多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代-多柔比星(morpholino-doxorubicin)、氰基吗啉代-多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、2-吡咯啉代-多柔比星(2-pyrrolino-doxorubicin)和脱氧多柔比星(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马塞罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)如丝裂霉素C、麦考酚酸(mycophenolicxa0acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代谢物如甲氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU);叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤、喋罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤类似物,如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine);嘧啶类似物,如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine);雄激素类,诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonexa0propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone);抗肾上腺药(anti-adrenals),如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂,如亚叶酸(folinicxa0acid);醋葡醛内酯(aceglatone);aldophosphamidexa0glycoside;5-氨基酮戊酸(aminolevulinicacid);恩尿嘧啶(eniluracil);安吖啶(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate);defofamine;秋水仙胺(demecolcine);地吖醌(diaziquone);elfornithine;依利醋铵(elliptiniumxa0acetate);epothilone;依托格鲁(etoglucid);硝酸镓(galliumxa0nitrate);羟脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼达明(lonidainine);美登木素生物碱类(maytansinoids),如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocins);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌达醇(mopidanmol);尼曲吖啶(nitraerine);喷司他丁(pentostatin);异丙嗪(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);鬼臼酸(podophyllinicxa0acid);2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="151"/>多糖复合物(JHSxa0NaturalProducts(JHS天然产品),Eugene,OR);雷佐生(razoxane);利索新(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);锗螺胺(spirogermanium);细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid);三亚胺醌(triaziquone);2,2’,2”-三氯三乙胺(2,2’,2”-trichlorotriethylamine);单端孢霉烯族化合物(trichothecenes)(特别是T-2毒素、verracurinxa0A、杆孢菌素A(roridinxa0A)和anguidine);乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine);达卡巴嗪(dacarbazine);甘露莫司汀(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴卫矛醇(mitolactol);哌泊溴烷(pipobroman);gacytosine;阿拉伯糖苷(arabinoside)(“Ara-C”);环磷酰胺;塞替哌(thiotepa);紫杉烷类化合物(taxoids),例如,ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="233"/>紫杉醇(Bristol-Myersxa0Squibbxa0Oncology,Princeton,新泽西),ABRAXANE^TM无克列莫佛(Cremophor-free)、紫杉醇的白蛋白改造的纳米颗粒制剂(Americanxa0Pharmaceuticalxa0Partners,Schaumberg,伊利诺伊州);和ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="343"/>多西他赛(doxetaxel)(ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="152"/>-Poulencxa0Rorer,Antony,法国);chloranbucil;ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="288"/>吉西他滨(gemcitabine);6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine);巯嘌呤(mercaptopurine);甲氨喋呤;铂类似物,如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin);长春碱(vinblastine);铂;依托泊苷(etoposide)(VP-16);异环磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);长春新碱(vincristine);ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="370"/>长春瑞滨(vinorelbine);诺安托(novantrone);替尼泊苷(teniposide);依达曲沙(edatrexate);柔红霉素(daunomycin);氨基喋呤(aminopterin);希罗达(xeloda);伊班膦酸盐(ibandronate);伊立替康(irinotecan)(Camptosar,CPT-11)(包括伊立替康与5-FU和亚叶酸(leucovorin)的治疗方案);拓扑异构酶抑制剂RFSxa02000;二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine)(DMFO);维甲类(retinoids),如视黄酸(retinoicxa0acid);卡培他滨(capecitabine);康普瑞汀(combretastatin);VELCADE硼替佐米(bortezomib);REVLIMID来那度胺(lenalidomide);亚叶酸(leucovorin)(LV);奥沙利铂(oxaliplatin),包括奥沙利铂治疗方案(FOLFOX);下列的抑制剂:PKC-α,Raf,H-Ras,EGFR(例如,厄洛替尼(erlotinib)(Tarceva^TM))和VEGF-A,所述抑制剂减少细胞增殖,以及上述任一种的药用盐、酸或衍生物。抗激素试剂也包含在这一定义中,其起作用调控或抑制激素对肿瘤的作用,如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERMs),其包括,例如,他莫昔芬(tamoxifen)(包括ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="355"/>他莫昔芬),雷洛昔芬(raloxifene),屈洛昔芬(droloxifene),4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen),曲沃昔芬(trioxifene),keoxifene,LY117018,奥那司酮(onapristone),和FARESTON·托瑞米芬(toremifene);抑制芳香酶的芳香酶抑制剂,其调节肾上腺中的雌激素生产,诸如例如,4(5)-咪唑,氨鲁米特(aminoglutethimide),ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="283"/>醋酸甲地孕酮(megestrolacetate),ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="353"/>依西美坦(exemestane),福美坦(formestanie),法倔唑(fadrozole),ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="275"/>伏氯唑(vorozole),ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="285"/>来曲唑(letrozole),和ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="333"/>阿那曲唑(anastrozole);和抗雄激素类,如氟他胺(flutamide),尼鲁米特(nilutamide),比卡鲁胺(bicalutamide),亮丙立德(leuprolide),和戈舍瑞林(goserelin);以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物(1,3-dioxolanexa0nucleosidecytosinexa0analog));反义寡核苷酸,特别是抑制异常细胞增殖中所涉及的信号传导途径中的基因(诸如例如,PKC-α,Raf和H-Ras)表达的那些;核酶如VEGF表达抑制剂(例如,ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="395"/>核酶)和HER2表达抑制剂;疫苗如基因治疗疫苗,例如,ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="411"/>疫苗,ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="369"/>疫苗,和ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="222"/>疫苗;ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="373"/>rIL-2;ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="427"/>拓扑异构酶1抑制剂;ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="337"/>rmRH;长春瑞滨(Vinorelbine)和埃斯波霉素(Esperamicins)(参见美国专利号4,675,187),以及上述任一种的药用盐、酸或衍生物。术语“前药”用在本申请中是指药物活性物质的前体或衍生物形式,其较亲本药物对肿瘤细胞的细胞毒性更小并且能够被酶活化或转化为更具活性的亲本形式。参见,例如,Wilman,′′Prodrugsxa0inxa0CancerChemotherapy(癌症化疗中的前药)′′Biochemicalxa0Societyxa0Transactions(生物化学学会学报),14,第375-382页,615thxa0Meetingxa0Belfast(1986)和Stella等,′′Prodrugs:Axa0Chemicalxa0Approachxa0toxa0Targetedxa0Drugxa0Delivery,(前药:靶向药物递送的化学方法)′′Directedxa0Drugxa0Delivery(定向药物递送),Borchardt等,(编辑),第247-267页,Humanaxa0Press(1985)。本发明的前药包括,但不限于,含磷酸盐的前药,含硫代磷酸盐的前药,含硫酸盐的前药,含肽的前药,D-氨基酸修饰的前药,糖基化前药,含β-内酰胺的前药,含任选取代的苯氧基乙酰胺的前药或含任选取代的苯基乙酰胺的前药,可以被转化为更具活性的无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前药。可以被衍生成用于本发明的前药形式的细胞毒性药物的实例包括,但不限于,上述那些化疗剂。“放射性治疗”意指使用定向的γ射线或β射线诱导充分的细胞损害,从而限制其正常行使功能的能力或完全破坏细胞。应该理解,本领域中存在已知的多种方式来确定治疗的剂量和持续时间。典型的治疗提供为一次施用并且典型的剂量在10-200单位(Grays)/天范围内。′′生物学样品′′(可相互替换地称为“样品”或“组织或细胞样品”)涵盖从个体获得的多种样品类型并可用于诊断或监测测定中。该定义涵盖生物学来源的血和其它液体样品,实体组织样品如活组织检查样品或组织培养物或由其衍生的细胞,以及其后代。该定义也包括在它们获得后以任何方式操作的样品,如用试剂处理,增溶,或富集某些成分如蛋白或多核苷酸,或包埋在半固体或固体基质中用于切片的目的。术语′′生物学样品′′涵盖临床样品,并也包括培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物学液体和组织样品。生物学样品的来源可以是实体组织,来自于新鲜、冷冻和/或储存的器官或组织样品或活组织检查或抽吸;血液或任何血液成分;体液如脑脊液、羊水、腹水或间质液;来自于个体孕育或发育中的任何时间的细胞。在一些实施方案中,生物学样品从原发性或转移肿瘤中获得。生物学样品可含有本身与组织不天然混合的化合物如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养素、抗生素等。为了本文的目的,组织样品的“切片”是指组织样品的单一部分或片,例如,从组织样品切取的组织薄片或细胞。要理解可以取组织样品的多个切片并根据本发明进行分析。在一些实施方案中,组织样品的同一切片在形态学和分子水平两者上进行分析,或关于蛋白和核酸两者进行分析。词语“标记物”当在本文中使用时是指直接或间接与试剂诸如核酸探针或抗体缀合或融合并促进与其缀合或融合的试剂的检测的化合物或组合物。所述标记物可以本身是可检测的(例如,放射同位素标记物或荧光标记物),或者,在酶标记物的情形中,可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。本发明的组合物和方法本发明涵盖组合物,包括药物组合物,它们包含抗-FGFR3抗体;并且涵盖包含编码抗-FGFR3抗体的序列的多核苷酸。当在本文中使用时,组合物包含一种或多种结合FGFR3的抗体,和/或一种或多种包含编码一种或多种结合FGFR3的抗体的序列的多核苷酸。这些组合物可以进一步包含合适的载体,诸如药用赋形剂,所述药用赋形剂包括缓冲剂,它们在本领域中是公知的。本发明还涵盖分离的抗体和多核苷酸实施方案。本发明还涵盖基本上纯的抗体和多核苷酸实施方案。本发明还涵盖使用抗-FGFR3抗体(如本文所述或如本领域中已知的)治疗病症,例如多发性骨髓瘤或过渡期癌症(例如,侵袭性过渡期癌症)的方法。组合物本发明的抗-FGFR3抗体优选是单克隆的。还涵盖在本发明的范围内的有本文提供的抗-FGFR3抗体的Fab,Fab′,Fab′-SH和F(ab′)₂片段。这些抗体片段可以通过传统手段形成,诸如酶消化,或可以通过重组技术生成。这样的抗体片段可以是嵌合的或人源化的。这些片段可用于下面给出的诊断和治疗目的。单克隆抗体从基本上同质的抗体的群体获得,即,包含该单一抗体的群体除了可能天然存在的突变以外均是相同的,所述天然存在的突变可能以微量存在。因此,修饰语“单克隆”表示抗体的特征不是毫无联系的抗体的混合物。本发明的抗-FGFR3单克隆抗体可以使用最初由Kohler等,Nature(自然),256:495(1975)描述的杂交瘤法制备,或可以通过重组DNA方法(美国专利号4,816,567)制备。在杂交瘤方法中,将小鼠或其它适当的宿主动物(如仓鼠)免疫以激发产生或能够产生特异性结合用于免疫的蛋白的抗体的淋巴细胞。针对FGFR3的抗体可以在动物中通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射FGFR3和佐剂来产生。FGFR3可以使用本领域中公知的方法来制备,在本文中进一步描述这些方法中的一些。例如,下面描述人和鼠FGFR3的重组产生。在一个实施方案中,将动物用与免疫球蛋白重链的Fc部分融合的FGFR3免疫。在优选的实施方案中,将动物用FGFR3-IgG1融合蛋白免疫。动物通常针对FGFR3与单磷酰基脂质A(MPL)/海藻糖dicrynomycolate(trehalosexa0dicrynomycolate)(TDM)(Ribixa0Immunochem.Research,Inc.,Hamilton,MT)的免疫原性缀合物或衍生物免疫并且将该溶液在多个部位皮内注射。两周后将动物加强免疫。7至14天后,将动物放血并且测定血清的抗-FGFR3效价。将动物加强免疫直至效价达到稳定期。备选地,淋巴细胞可以在体外免疫。然后,使用适当的融合剂,如聚乙二醇,将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonalxa0Antibodies:Principlesxa0andxa0Practice(单克隆抗体:原理与实践),第59-103页(Academicxa0Press,1986))。将这样制备的杂交瘤接种和生长在适当的培养基中,所述培养基优选地包含一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。例如,如果亲本骨髓瘤细胞缺少这样的酶,即次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT),则用于杂交瘤的培养基典型地将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤、和胸苷(HAT培养基),所述物质防止HGPRT-缺陷型细胞生长。优选的骨髓瘤细胞是有效融合、支持所选择的生产抗体的细胞的稳定的高水平抗体生产、并且对诸如HAT培养基的培养基敏感的那些细胞。其中,优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤株系,诸如来源于MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些,其可从美国加利福尼亚州圣地亚哥的Salk细胞配送中心研究所(Salkxa0Institutexa0Cellxa0Distributionxa0Center,Sanxa0Diego,Californiaxa0USA)获得,以及SP-2或X63-Ag8-653细胞,其可从美国马里兰州Rockville的美国典型培养物保藏中心(Americanxa0Typexa0CultureCollection,Rockville,Marylandxa0USA)获得。也记述了人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系,其用于生产人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.(免疫学杂志),133:3001(1984);Brodeur等,Monoclonalxa0Antibodyxa0ProductionTechniquesxa0andxa0Applications(单克隆抗体生产技术和应用),第51-63页(Marcelxa0Dekker,Inc.,纽约,1987))。测定其中杂交瘤细胞正在生长的培养基中针对FGFR3的单克隆抗体的产生。优选地,通过免疫沉淀或通过体外结合测定,诸如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA),来确定由杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲合力可以,例如,通过Munson等,Anal.Biochem.(分析生物化学),107:220(1980)的Scatchard分析测定。在鉴定了生产具有所需要的特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后,可以通过有限的稀释步骤亚克隆该克隆,并且通过标准方法(Goding,Monoclonalxa0Antibodies:Principlesxa0andxa0Practice(单克隆抗体:原理和实践),第59-103页(Academicxa0Press,1986))生长。适用于该目的的培养基包括,例如,D-MEM或RPMI-1640培养基。另外,杂交瘤细胞可以在动物中作为腹水瘤体内生长。通过常规免疫球蛋白纯化方法,诸如例如,蛋白质A-琼脂糖、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析,适当地从培养基、腹水液、或血清中分离由亚克隆分泌的单克隆抗体。可以通过使用组合文库筛选具有所需的一种或多种活性的合成抗体克隆来制备本发明的抗FGFR3抗体。原则上,通过筛选包含这样的噬菌体的噬菌体文库来选择合成的抗体克隆,所述噬菌体展示融合于噬菌体外壳蛋白的抗体可变区(Fv)的各种片段。所述噬菌体文库通过针对需要的抗原的亲和层析法进行淘选。将表达能够结合需要的抗原的Fv片段的克隆吸附到抗原上,并且由此与在文库中未结合的克隆分离。接着从抗原上洗脱结合的克隆,并且可以进一步通过另外的抗原吸附/洗脱循环富集。本发明的任一种抗-FGFR3抗体可以通过下述获得:设计适合的抗原筛选方法以选择目的噬菌体克隆,随后使用来自目的噬菌体克隆的Fv序列和在Kabat等,免疫学感兴趣的蛋白的序列(Sequencexa0ofxa0Proteinsxa0ofImmunologicalxa0Interest),第5版,NIH出版物91-3242,Bethesdaxa0MD(1991),卷1-3中所述的适合的恒定区(Fc)序列构建全长抗-FGFR3抗体克隆。抗体的抗原结合结构域由约110个氨基酸的两个可变(V)区形成,每个分别来自轻链(VL)和重链(VH),并且都具有三个高变环或互补性决定区(CDRs)。可变结构域可以功能上展示在噬菌体上,或者作为单链Fv(scFv)片段展示,其中VH和VL通过短的柔性肽共价连接,或作为Fab片段展示,其中它们分别融合于恒定结构域并且非共价地相互作用,如在Winter等,Ann.Rev.Immunol.(免疫学年度综述),12:433-455(1994)中所述。用于本文时,编码scFv的噬菌体克隆和编码Fab的噬菌体克隆统称为“Fv噬菌体克隆”或′′Fv克隆′′。VH和VL基因的所有组成成分可以通过聚合酶链式反应(PCR)单独克隆并且随机重组在噬菌体文库中,其接着可以关于抗原结合克隆被探究,如在Winter等,Ann.Rev.Immunol.(免疫学年度综述),12:433-455(1994)中所述。来自免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和性抗体,而不需要构建杂交瘤。备选地,可以克隆天然的所有组成成分从而在无需任何免疫的条件下提供针对广泛范围的非自体抗原以及自体抗原的人抗体的单一来源,如在Griffiths等,EMBOxa0J,12:725-734(1993)中所述。最终,还可以通过从干细胞克隆未重排的V-基因区段,并使用包含随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并实现体外重排来合成制备天然文库,如由Hoogenboom和Winter,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),227:381-388(1992)所述。将丝状噬菌体用于通过融合于较小的外壳蛋白pIII来展示抗体片段。所述抗体片段可以作为单链Fv片段展示,其中VH和VL结构域在相同的多肽链上通过柔性多肽间隔臂连接,例如如由Marks等,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),222:581-597(1991)所述,或作为Fab片段展示,其中一条链融合于pIII,而另一条链分泌到细菌宿主细胞周质中,其中组装Fab-外壳蛋白结构,其通过取代一些野生型外壳蛋白而展示在噬菌体表面上,如在Hoogenboom等,核酸研究(Nucl.Acidsxa0Res).,19:4133-4137(1991)中所述。一般地,编码抗体基因片段的核酸获自从人或动物中收集的免疫细胞。如果需要偏向有利于抗-FGFR3克隆的文库,用FGFR3来免疫个体从而产生抗体反应,并且回收脾细胞和/或循环B细胞、其它的外周血淋巴细胞(PBLs)用于文库构建。在一个优选的实施方案中,在携带功能性人免疫球蛋白基因阵列(并且缺乏功能性内源抗体生产系统)的转基因小鼠中通过产生抗-FGFR3抗体反应来获得偏向有利于抗-FGFR3克隆的人抗体基因片段文库,从而使FGFR3免疫提供产生针对FGFR3的人抗体的B细胞。在下面描述生产人抗体的转基因小鼠的产生。可以通过使用适合的筛选方法来分离表达FGFR3-特异性膜结合抗体的B细胞来获得对抗-FGFR3反应性细胞群体的另外的富集,例如通过使用FGFR3亲和层析法分离细胞或将细胞吸附到荧光染料标记的FGFR3,随后进行流式激活的细胞分选(flow-activatedxa0cellxa0sorting)(FACS)而进行。备选地,应用来自未被免疫的供体的脾细胞和/或B细胞或其它PBLs提供可能的抗体所有组成成分的更好的呈现,并且还允许使用任何其中FGFR3不是抗原性的动物(人或非人)物种来构建抗体文库。对于体外结合抗体基因的文库构建,从个体中收集干细胞从而提供编码未重排的抗体基因区段的核酸。可以从多种动物物种,如人、小鼠、大鼠、兔类、luprine、犬、猫、猪、牛、马和禽类物种等获得目的免疫细胞。从目的细胞中回收编码抗体可变基因区段(包括VH和VL区段)的核酸,并且进行扩增。在重排的VH和VL基因文库的情形中,可以通过从淋巴细胞中分离基因组DNA或mRNA,随后用匹配重排VH和VL基因的5′和3′端的引物进行聚合酶链式反应(PCR)来获得需要的DNA,如在Orlandi等,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)),86:3833-3837(1989)中所述,由此制备多样的V基因所有组成成分进行表达。可以从cDNA和基因组DNA扩增V基因,其中反向引物(backxa0primers)在编码成熟V-结构域的外显子5′端,而正向引物基于J-区段中,如在Orlandi等(1989)和Ward等,自然(Nature),341:544-546(1989)中所述。然而,对于从cDNA中扩增,反向引物也可以基于前导外显子中,如在Jones等,生物技术(Biotechnol.),9:88-89(1991)中所述,而正向引物在恒定区内,如在Sastry等,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)),86:5728-5732(1989)中所述。为了使互补性最大化,可以将简并性结合在引物中,如在Orlandi等(1989)或Sastry等(1989)中所述。优选地,通过使用靶向每个V基因家族的PCR引物以扩增在免疫细胞核酸样品中存在的所有可获得的VH和VL排列来使文库多样性最大化,例如在Marks等,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),222:581-597(1991)的方法中所述,或如在Orum等,核酸研究(Nucleicxa0Acidsxa0Res.),21:4491-4498(1993)的方法中所述。关于将扩增的DNA克隆到表达载体中,可以将稀有的限制性酶切位点作为在一端的标记引入PCR引物中,如在Orlandi等(1989)中所述,或通过用标记的引物进一步进行PCR扩增,如在Clackson等,自然(Nature),352:624-628(1991)中所述。合成的重排的V基因的所有组成成分可以在体外来自V基因区段。已经对大部分的人VH-基因区段进行克隆和测序(在Tomlinson等,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),227:776-798(1992)中报道),并进行作图(在Matsuda等,自然遗传学(Naturexa0Genet.),3:88-94(1993)中报道);可以将这些克隆的区段(包括H1和H2环的所有主要的构象)用于用编码多样序列和长度的H3环的PCR引物产生多样的VH基因的所有组成成分,如在Hoogenboom和Winter,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),227:381-388(1992)中所述。VH所有组成成分还可以用集中在单一长度的长H3环中的所有的序列多样性进行制备,如在Barbas等,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),89:4457-4461(1992)中所述。已经对人Vκ和Vλ区段进行克隆和测序(在Williams和Winter,欧洲免疫杂志(Eur.J.Immunol.),23:1456-1461(1993)中报道),并且可以用于制备合成的轻链所有组成成分。基于一系列(axa0rangexa0of)VH和VL折叠,和L3和H3长度的合成的V基因所有组成成分将编码具有相当多结构多样性的抗体。在扩增编码V-基因的DNA后,可以根据Hoogenboom和Winter,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),227:381-388(1992)的方法,将种系V-基因区段在体外进行重排。抗体片段的所有组成成分可以通过以数种方式将VH和VL基因的所有组成成分组合在一起而构建。每个所有组成成分可以在不同的载体中产生,所述载体可以在体外重组,例如如在Hogrefe等,基因(Gene),128:119-126(1993)中所述,或可以通过组合感染在体内重组,例如通过在Waterhouse等,核酸研究(Nucl.Acidsxa0Res).,21:2265-2266(1993)中所述的loxP系统。体内重组方法应用Fab片段的双链性质来克服由大肠杆菌转化效率对文库大小所施加的限制。将天然VH和VL所有组成成分单独克隆,一个克隆到噬菌粒中,并且另一个克隆到噬菌体载体中。接着将两种文库通过对包含噬菌粒的细菌的噬菌体感染进行组合从而使每个细胞包含不同的组合,并且文库大小仅由存在的细胞数量(约10¹²个克隆)限制。两种载体包含体内重组信号从而可以将VH和VL基因重组到单一复制子上并且共同包装到噬菌体病毒体中。这些巨大的文库提供大量的具有良好亲和性(K_d^-1约为10^-8M)的多种抗体。备选地,可以将所有组成成分顺序地克隆到同一载体中,例如如在Barbas等,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,)88:7978-7982(1991)中所述,或通过PCR装配在一起,并且接着进行克隆,例如如在Clackson等,自然(Nature),352:624-628(1991)中所述。还可以将PCR装配(PCRxa0assembly)用于将VH和VLxa0DNA与编码柔性肽间隔臂的DNA连接在一起形成单链Fv(scFv)所有组成成分。在其它的技术中,将“在细胞中的PCR装配(inxa0cellxa0PCRxa0assembly)”用于将VH和VL基因通过PCR组合在淋巴细胞中,并且接着克隆连接的基因的所有组成成分,如在Embleton等,核酸研究(Nucl.AcidsRes.),20:3831-3837(1992)中所述。由天然文库(自然的或合成的)产生的抗体可以具有中度亲和性(K_d^-1为约10⁶到10⁷M^-1),但是亲和力成熟也可以通过构建次级文库并且再次从所述文库中选择来在体外进行模拟,如在Winter等(1994),见上文中所述。例如,可以在Hawkins等,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),226:889-896(1992)的方法或Gram等,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Scixa0USA),89:3576-3580(1992)的方法中使用易错聚合酶(在Leung等,技术(Technique),1:11-15(1989)中报道),在体外随机引入突变。另外可以如下进行亲和力成熟:例如使用由引物(携带跨越目的CDR的随机序列)进行的PCR在选定的个体Fv克隆中随机突变一个或多个CDR,并且筛选具有更高亲和性的克隆。WOxa096/07754(公开于1996年3月14日)描述了一种在免疫球蛋白轻链的互补性决定区中诱导突变发生从而产生轻链基因的文库的方法。另一种有效方法是将通过噬菌体展示选择的VH或VL结构域与获自未免疫的供体的天然存在的V结构域变体的所有组成成分重组并且在数轮链改组中关于更高的亲和性进行筛选,如在Marks等,生物技术(Biotechnol.),10:779-783(1992)中所述。该技术允许产生具有10^-9M范围内的亲和性的抗体和抗体片段。FGFR3核酸和氨基酸序列在本领域中是已知的。编码FGFR3的核酸序列可以使用FGFR3的所需区的氨基酸序列来设计。如本领域中所公知的,存在两种主要的FGFR3的剪接同种型,即FGFR3IIIb和FGFR3IIIc。FGFR3序列在本领域中是公知的,并且可能包括UniProKB/Swiss-Prot登记号P22607(FGFR3IIIc)或P22607_2(FGFR3IIIb)的序列。FGFR3突变已经得以鉴定并且在本领域中是众所周知的,并且包括下列突变(参照UniProKB/Swiss-Prot登记号P22607(FGFR3IIIc)或P22607_2(FGFR3IIIb)中显示的序列):ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="653"/>编码FGFR3的核酸可以通过本领域中已知的多种方法制备。这些方法包括,但不限于,通过Engels等.,Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.,28:716-734(1989)中所述的任意方法化学合成,所述方法诸如三酯、亚磷酸酯、亚磷酰胺和H-膦酸酯法。在一个实施方案中,表达宿主细胞优选的密码子用于编码FGFR3的DNA的设计中。备选地,编码FGFR3的DNA可以从基因组或cDNA文库中分离。在构建编码FGFR3的DNA分子后,该DNA分子可操作地连接至表达载体(诸如质粒)中的表达控制序列,其中所述控制序列被用该载体转化的宿主细胞识别。通常,质粒载体包含复制和控制序列,它们来源于与该宿主细胞相容的物种。该载体通常携带复制位点,以及编码能够在转化的细胞中提供表型选择的蛋白的序列。用于在原核和真核宿主细胞中表达的合适载体是本领域中公知的,并且一些进一步在本文中描述。可以使用真核生物诸如酵母,或来源于多细胞生物体诸如哺乳动物的细胞。任选地,编码FGFR3的DNA可操作地连接至分泌前导序列,导致表达产物被宿主细胞分泌至培养基中。分泌前导序列的实例包括stII,ecotin,lamB,疱疹GD,lpp,碱性磷酸酶,转化酶和α因子。还适合用于本文中的有蛋白A的36个氨基酸前导序列(Abrahmsen等.,EMBOxa0J.,4:3901(1985))。宿主细胞用上述本发明的表达或克隆载体转染和优选转化,并且在根据情况适当改良的常规营养培养基中培养以诱导启动子、选择转化体,或扩增编码所需序列的基因。转染是指由宿主细胞摄取表达载体,无论是否实际表达任何编码序列。大量的转染方法是普通技术人员所公知的,例如,CaPO₄沉淀和电穿孔。通常当在宿主细胞中出现此载体工作的任何指征时识别成功的转染。转染的方法在本领域中是公知,并且在本文中进一步描述其中的一些。转化的含义是将DNA引入至生物体中使得DNA是可复制的,或作为染色体外元件或通过染色体整合体复制。取决于使用的宿主细胞,使用适合于此类细胞的标准技术完成转化。转化的方法在本领域中是公知,并且在本文中进一步描述其中的一些。用来产生FGFR3的原核宿主细胞可以如通常在Sambrook等.,见上文中所述进行培养。用来产生FGFR3的哺乳动物宿主细胞可以在多种培养基中培养,所述培养基在本领域中是公知的,并且在本文中描述其中的一些。本公开中提及的宿主细胞涵盖体外培养的细胞以及在宿主动物内的细胞。FGFR3的纯化可以使用本领域公认的方法来实现,本文描述其中的一些。纯化的FGFR3可以附着至合适的基质诸如琼脂糖珠,丙烯酰胺珠,玻璃珠,纤维素,各种丙烯酸共聚物,甲基丙烯酸羟基酯凝胶,聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸共聚物,尼龙,中性和离子载体,等等,从而用于噬菌体展示克隆的亲合层析分离中。FGFR3蛋白附着到基质上可以通过Methodsinxa0Enzymology(酶学方法),vol.44(1976)中所述的方法来实现。普遍被采用用于将蛋白配体附着于多糖基质(例如,琼脂糖,葡聚糖或纤维素)的技术涉及用卤化氰活化载体,随后将肽配体的伯脂族或芳族胺与活化的基质偶联。备选地,FGFR3用于包被吸附板的孔,并且在粘附于吸附板的宿主细胞上表达或用于细胞分选,或缀合于生物素从而用链霉抗生物素蛋白包被的珠进行捕获,或用在任何对噬菌体展示文库进行淘选的其它本领域公知的方法中。在适合将噬菌体颗粒的至少一部分与吸附剂结合的条件下,将噬菌体文库样品与固定的FGFR3接触。在正常情况下,选择所述条件,包括pH,离子强度,温度等来模拟生理条件。对结合于固相的噬菌体进行洗涤并且接着用酸洗脱,例如如在Barbas等,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Scixa0USA),88:7978-7982(1991)中所述,或用碱洗脱,例如如在Marks等,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),222:581-597(1991)中所述,或通过FGFR3抗原竞争洗脱,例如以类似于Clackson等,自然(Nature),352:624-628(1991)的抗原竞争方法的方法进行。可以将噬菌体在单轮选择中富集20-1,000倍。而且可以将富集的噬菌体生长在细菌培养物中并且进行另几轮的选择。选择的效率取决于许多因素,包括在洗涤过程中解离的动力学,以及在单个噬菌体上的多种抗体片段是否可以同时与抗原结合(engage)。可以通过使用短暂洗涤,多价噬菌体展示以及抗原在固相中的高度包被密度保持具有快速解离动力学(以及弱的结合亲和性)的抗体。高密度不仅通过多价相互作用稳定所述噬菌体,而且有利于解离的噬菌体的再次结合。可以通过使用长时间洗涤,和如在Bass等,蛋白质(Proteins),8:309-314(1990)和在WOxa092/09690中所述的单价噬菌体展示,以及在Marks等,生物技术(Biotechnol).,10:779-783(1992)中所述的低包被密度的抗原来促进对具有缓慢解离动力学(和良好结合亲和性)的抗体的选择。可以在对于FGFR3具有不同亲和性(甚至具有稍稍不同的亲和性)的噬菌体抗体之间进行选择。然而,选定的抗体的随机突变(例如,如在上述亲和力成熟技术中的一些中进行的)可能产生了许多突变体,大部分与抗原结合,并且其中一些具有更高的亲和性。以FGFR3为限制条件,只有极少的高亲和性噬菌体可以竞争胜出。为了保留所有的更高亲和性的突变体,噬菌体可以用过量的生物素化的FGFR3温育,但是所述生物素化的FGFR3的浓度低于关于FGFR3的靶摩尔亲和性常数的摩尔浓度。接着,所述高亲和性结合的噬菌体被链霉抗生物素蛋白包被的顺磁珠(paramagneticxa0beads)捕获。所述“平衡捕获”允许抗体根据它们的结合亲和性进行选择,其敏感性允许从大量过量的具有较低亲和性的噬菌体中分离少至两倍更高亲和性的突变体克隆。还可以对在洗涤结合于固相的噬菌体中所用的条件进行操作以基于解离动力学进行区分。可以通过活性来选择FGFR3克隆。在一个实施方案中,本发明提供这样的FGFR3抗体,其阻断FGFR3受体及其配体(诸如FGF1和/或FGF9)之间的结合。可以通过下述来选择对应于所述FGFR3抗体的Fv克隆:(1)从如上所述的噬菌体文库中分离FGFR3克隆,并且任选地通过在适合的细菌宿主中增殖所述群体扩增分离的噬菌体克隆群体;(2)选择针对其分别需要阻断和不阻断活性的FGFR3和第二蛋白;(3)将抗-FGFR3噬菌体克隆吸附于固定的FGFR3;(4)使用过量的第二蛋白洗脱任何识别这样的FGFR3-结合决定簇的不需要的克隆,所述决定簇与第二蛋白的结合决定簇重叠或共享;和(5)在步骤(4)之后,洗脱保持被吸附的克隆。任选地,可以通过重复本文所述的选择方法一次或多次来进一步富集具有需要的封闭/不封闭性质的克隆。编码本发明的杂交瘤来源的单克隆抗体或噬菌体展示Fv克隆的DNA容易使用常规方法进行分离和测序(例如通过使用设计用来特异性扩增来自杂交瘤或噬菌体DNA模板的目的重链和轻链编码区的寡核苷酸引物)。一旦分离,可以将所述DNA置于表达载体中,将其接着转染到宿主细胞如大肠杆菌(E.coli)细胞中,猿猴COS细胞中,中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中,或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中,从而在重组宿主细胞中获得需要的单克隆抗体的合成。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文献包括Skerra等,现代免疫学观点(Curr.Opinionxa0inImmunol.),5:256(1993)和Pluckthun,免疫学综述(Immunol.Revs),130:151(1992)。可以将编码本发明的Fv克隆的DNA与编码重链和/或轻链恒定区的已知DNA序列(例如可以获自Kabat等,见上文的适合的DNA序列)组合从而形成编码全长或部分长度的重链和/或轻链的克隆。要理解的是,任何同种型的恒定区可以用于该目的,包括IgG,IgM,IgA,IgD,和IgE恒定区,并且所述恒定区可以获自任何人或动物物种。来自一种动物(如人)物种的可变结构域DNA的Fv克隆并接着与另一种动物物种的恒定区DNA融合从而形成关于“杂合”全长重链和/或轻链的编码序列,这包含在本文所用的“嵌合体”和“杂合”抗体的定义中。在优选实施方案中,将衍生自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合从而形成关于全部人的全长或部分长度的重链和/或轻链的编码序列。例如,还可以通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代来自杂交瘤克隆的同源鼠序列来修饰衍生自本发明的杂交瘤的编码抗-FGFR3抗体的DNA(例如,如在Morrison等,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),81:6851-6855(1984)的方法中)。可以通过将免疫球蛋白编码序列共价连接于非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列来进一步修饰编码杂交瘤或Fv克隆来源的抗体或片段的DNA。以这种方式,制备这样的“嵌合”或“杂合”抗体,其具有本发明的Fv克隆或杂交瘤克隆衍生的抗体的结合特异性。抗体片段本发明涵盖抗体片段。在某些情形中,存在使用抗体片段,而不是使用完整抗体的益处。更小的片段大小容许快速清除,并且可以导致提高的对实体瘤的接近。已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上,通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等,生物化学和生物物理方法杂志(Journalxa0ofxa0Biochemicalxa0andxa0Biophysicalxa0Methods)24:107-117(1992);和Brennan等,科学(Science)229:81(1985))。然而,现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab,Fv和ScFv抗体片段都可以在大肠杆菌中表达并且分泌,由此导致容易产生大量的这些片段。可从上文讨论的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者,可直接从大肠杆菌回收Fab’-SH片段并化学偶联以形成F(ab’)₂片段(Carter等,生物/技术(Bio/Technology)10:163-167(1992))。根据另一种方法,可以直接从宿主细胞培养物中分离F(ab’)₂片段。包含补救受体结合表位残基具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab’)₂片段在美国专利号5,869,046中描述。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员将是显而易见的。在其他实施方案中,选择的抗体是单链Fv片段(scFv)(参见,例如,WO93/16185;美国专利号5,571,894及5,587,458)。Fv和sFv是具有完整结合位点、缺少恒定区的唯一类型;如此,它们适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建sFv融合蛋白以产生效应子蛋白质在sFv的氨基末端或羧基末端的融合。参见抗体改造(Antibodyxa0Engineering),Borrebaeck编,见上文。抗体片段还可以是“线性抗体”,例如如美国专利号5,641,870中所记载的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。人源化的抗体本发明涵盖人源化抗体。在本领域中已知用于人源化非人抗体的各种方法。例如,人源化抗体可以具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基,它们典型的取自“输入”可变结构域。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法(Jones等,(1986)自然(Nature)321:522-525;Riechmann等(1988),自然(Nature)332:323-327;Verhoeyen等(1988),科学(Science)239:1534-1536),通过用高变区序列取代相应的人抗体序列而进行。因而,此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567),其中基本上少于完整的人可变结构域用来自非人物种的相应序列置换。在实践中,人源化抗体典型的是其中一些高变区残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基置换的人抗体。用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链二者)的选择对于降低抗原性非常重要。依照所谓的“最适”(best-fit)方法,针对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿类抗体的可变结构域序列。然后接受与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人构架。(Sims等(1993),免疫学杂志(J.Immunol.)151:2296;Chothia等(1987),分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196:901)。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定构架。同一构架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等(1992),美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acadxa0Sci.USA)89:4285;Presta等(1993),免疫学杂志(J.Immunol.)151:2623。更重要的是,抗体在人源化后保持对抗原的高亲和性及其它有利的生物学特性。为了实现这一目标,依照一种方法,通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是公众可获得的,且为本领域技术人员所熟悉。可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能行使中的可能作用,即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式,可从接受体和输入序列中选出FR残基并进行组合,从而获得期望的抗体特征,如对于靶抗原增加的亲和性。一般而言,高变区残基直接且最实质地参与影响对抗原的结合。人抗体本发明的人抗-FGFR3抗体可以通过组合选自人来源的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列和如上所述的已知人恒定结构域序列构建。备选地,本发明的人单克隆抗-FGFR3抗体可以通过杂交瘤方法制备。用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系已经在例如Kozbor免疫学杂志(J.Immunol.),133:3001(1984);Brodeur等,单克隆产生技术和应用(Monoclonalxa0Productionxa0Techniquesxa0andApplications),第51-63页(Marcelxa0Dekker,Inc.,纽约,1987);和Boerner等,免疫学杂志(J.Immunol.),147:86(1991)中进行描述。现在有可能产生在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如,已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits等,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:2551(1993);Jakobovits等,自然(Nature)362:255(1993);Bruggermann等,Yearxa0inxa0Immunol.,7:33(1993)。还可以将基因改组用于从非人,例如啮齿类动物抗体衍生人抗体,其中人抗体具有与起始的非人抗体相似的亲和性和特异性。根据该方法,其也称为“表位印刻(epitopexa0imprinting)”,将通过如上所述的噬菌体展示技术获得的非人抗体片段的重链或轻链可变区用人V结构域基因的所有组成部分取代,产生非人链/人链scFv或Fab嵌合体的群体。用抗原进行选择导致非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离,其中人链恢复了在初级噬菌体展示克隆中去除了相应的非人链之后被破坏的抗原结合位点,即表位支配(印刻)人链配偶体的选择。当重复所述方法从而取代余下的非人链时,获得人抗体(见在1993年4月1日公开的PCTxa0WOxa093/06213)。不像通过CDR移植对非人抗体进行的传统人源化,这种技术提供完整的人抗体,其不具有非人来源的FR或CDR残基。双特异性抗体双特异性抗体是对于至少两种不同的抗原具有结合特异性的单克隆抗体,优选是人抗体或人源化抗体。在这种情况下,一种结合特异性是关于FGFR3的,而另一种是关于任何其它抗原的。示例性的双特异性抗体可以结合FGFR3的两种不同的表位。还可以将双特异性抗体用于将细胞毒性药剂定位到表达FGFR3的细胞。这些抗体具有FGFR3-结合臂和结合细胞毒性药剂的臂(所述细胞毒性药剂例如,肥皂草毒蛋白(saporin)、抗-干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)。可以将双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段(例如,F(ab′)₂双特异性抗体)。用于生成双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上,双特异性抗体的重组生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达,其中两条重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello,自然(Nature)305:537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配,这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物,其中只有-种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的方法披露于在1993年5月13日公开的WOxa093/08829及Traunecker等,EMBOxa0J.10:3655(1991)。依照一种不同且更优选的方法,将具有期望的结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。融合体优选具有包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定结构域。优选在至少一种融合体中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和需要时的编码免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体,并共转染入合适的宿主生物体。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中,这为调整三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而,在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时,有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体中。在该方法的一个优选实施方案中,双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链,和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径,因此发现这种不对称结构便于将想要的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WOxa094/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等,酶学方法(Methodsxa0inxa0Enzymology)121:210(1986)。依照另一种方法,可改造一对抗体分子间的界面,以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。该优选界面包含抗体恒定结构域的至少部分CH3结构域。在该方法中,将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)置换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)置换,在第二抗体分子的界面上产生与大侧链大小相同或相似的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物(诸如同二聚体)提高异二聚体产量的机制。双特异性抗体包括交联的或“异源缀合的”抗体。例如,在异源缀合抗体中的一种抗体可以与抗生物素蛋白偶联,另一种抗体可以与生物素偶联。所述抗体已经例如被提议靶向免疫系统细胞到不想要的细胞(美国专利号4,676,980),并且用于治疗HIV感染(WOxa091/00360,WOxa092/00373,和EPxa003089)。可以使用任何便利的交联方法制备异源缀合抗体。适合的交联试剂是本领域中公知的,并且连同许多交联技术在美国专利号4,676,980中公开。文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如,可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等,科学(Science)229:81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab’)₂片段的方法。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠时还原,以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab’-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab’-硫醇,并与等摩尔量的另一种Fab’-TNB衍生物混合,以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。最新的进展便于从大肠杆菌直接回收Fab’-SH片段,这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等,J.Exp.Med.(实验医学杂志)175:217-225(1992)记载了完全人源化的双特异性抗体F(ab’)₂分子的生成。由大肠杆菌分别分泌每种Fab’片段,并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达HER2受体的细胞和正常人T细胞,以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳瘤靶标的裂解活性。还记载了从重组细胞培养物直接生成和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如,已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny等,免疫学杂志(J.Immunol.)148(5):1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab’部分连接。抗体同型二聚体在铰链区还原以形成单体,然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同型二聚体。Hollinger等,美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了生成双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL),所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因而,迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对,由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体生成双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等,免疫学杂志(J.Immunol.),152:5368(1994)。涵盖具有超过二价的抗体。例如,可制备三特异性抗体。Tutt等,免疫学杂志(J.Immunol.)147:60(1991)。多价抗体多价抗体可以比二价抗体更快的受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内在化(和/或异化(catabolized))。本发明的抗体可以是可容易的通过重组表达编码抗体多肽链的核酸而生成的、具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(除IgM类别以外的)。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种情况中,抗体将包含Fc区及Fe区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。本文优选的多价抗体包含(或由其组成)三个至约八个,但优选四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(和优选两条多肽链),其中所述多肽链包含两个或更多可变结构域。例如,多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc,其中VD1是第一可变结构域,VD2是第二可变结构域,Fc是Fc区的一条多肽链,X1和X2代表氨基酸或多肽,而n是0或1。例如,多肽链可包含:VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链;或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体优选进一步包含至少两条(和优选四条)轻链可变结构域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变结构域多肽。本文涵盖的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域,且任选进一步包含CL结构域。抗体变体在一些实施方案中,预期本文所述的抗体的氨基酸序列修饰。例如,可能需要提高抗体的结合亲合力和/或其它生物学性质。通过将适合的核苷酸变化引入抗体核酸,或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。所述修饰包括,例如在抗体的氨基酸序列中缺失残基和/或插入残基,和/或置换残基。进行缺失、插入和置换的任何组合从而得到最终的构建体,条件是最终的构建体具有需要的特征。在制备该序列时,可以将氨基酸改变引入目标抗体氨基酸序列。用于鉴定对于突变发生是优选位置的抗体的某些残基或区域的有用方法被称为“丙氨酸分区诱变法(alaninexa0scanningxa0mutagenesis)”,如Cunningham和Wells(1989)科学(Science),244:1081-1085所述。在此处,鉴定了一种残基或一组靶残基(例如带电荷的残基如arg,asp,his,lys,和glu),并且用中性或带负电荷氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)置换从而影响氨基酸与抗原的相互作用。然后,通过在置换位点或关于置换位点引入另外的或其它变体来精选显示对置换的功能敏感性的那些氨基酸位置。因此,当预先确定引入氨基酸序列变化的位点时,突变本身的性质不需要被预先确定。例如,为了分析在给定位点的突变的性能,在靶密码子或靶区进行丙氨酸分区诱变或随机诱变并且关于需要的活性筛选表达的免疫球蛋白。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基端融合,长度范围在1个残基到包含一百个以上残基的多肽,以及单一氨基酸残基或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N端或C端与增加抗体的血清半衰期的酶(例如,关于ADEPT)或多肽的融合。多肽的糖基化典型地是N-连接或O-连接的。N-连接指糖结构部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸的三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸,是关于将糖结构部分酶促连接于天冬酰胺侧链的识别序列。因此,在多肽中这些三肽序列中任一个的存在产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖之一连接于羟基氨基酸,最常见连接于丝氨酸或苏氨酸,尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。常规情况下,在抗体上加入糖基化位点通过改变氨基酸序列完成,使得其包含一个或多个上述三肽序列(关于N-连接的糖基化位点)。还可以通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基加入至起始抗体序列或通过置换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行所述改变(对于O-连接的糖基化位点)。如果抗体包含Fc区,那么可以改变其连接的糖。例如,在美国专利申请号USxa02003/0157108(Presta,L.)中记述了具有成熟的糖结构的抗体,其缺少连接在抗体Fc区上的岩藻糖。还参见USxa02004/0093621(KyowaHakkoxa0Kogyoxa0Co.,Ltd)。在连接到抗体Fc区上的糖中具有平分型N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine)(GlcNAc)的抗体参见WOxa02003/011878,Jean-Mairet等和美国专利号6,602,684,Umana等。WOxa01997/30087,Patel等报道了在连接到抗体Fc区上的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体。还参见WOxa01998/58964(Raju,S.)和WOxa01999/22764(Raju,S.),其关于具有连接到抗体Fc区上的改变的糖的抗体。还参见USxa02005/0123546(Umana等),其关于具有改变的糖基化的抗原结合分子。本文优选的糖基化变体包含Fc区,其中与Fc区连接的糖结构缺少岩藻糖。这样的变体具有改善的ADCC功能。任选地,Fc区中进一步包含一个或多个氨基酸置换,所述置换进一步改善ADCC,例如,Fc区的位置298,333,和/或334处(残基的Eu编号)的置换。涉及“脱岩藻糖基化”或“缺少岩藻糖的”抗体的公开物的实例包括:USxa02003/0157108;WO2000/61739;WOxa02001/29246;USxa02003/0115614;USxa02002/0164328;US2004/0093621;USxa02004/0132140;USxa02004/0110704;USxa02004/0110282;US2004/0109865;WOxa02003/085119;WOxa02003/084570;WOxa02005/035586;WO2005/035778;WO2005/053742;Okazaki等.J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)336:1239-1249(2004);Yamane-Ohnuki等.Biotech.Bioeng.(生物技术和生物工程)87:614(2004)。产生脱岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等.Arch.Biochem.Biophys.(生物化学和生物物理学集刊)249:533-545(1986);美国专利申请号US2003/0157108A1,Presta,L;和WOxa02004/056312A1,Adams等.,特别是实施例11),和敲除的细胞系,诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(Yamane-Ohnuki等.Biotech.Bioeng.(生物技术和生物工程)87:614(2004))。另一种类型的变体是氨基酸置换变体。这些变体在抗体分子中具有被不同的残基置换的至少一个氨基酸(至少两个,至少三个,至少4个以上)残基。用于置换诱变的最感兴趣的位点包括高变区,但是也预期FR改变。保守性置换在“优选的置换”的标题下在表1中显示。如果这样的置换导致生物活性的改变,则可以引入在表1中称为“示例性置换”或在下面参照氨基酸类别进一步描述的更多实质性的改变,并筛选产物。表1ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="499"/>抗体的生物学性质中的实质性修饰通过选择这样的置换来进行,所述置换在它们对下列的作用方面有显著差异:(a)保持在置换区域中的多肽主链的结构,例如,作为折叠或螺旋构象,(b)保持在靶位点处的分子的电荷或疏水性,或(c)保持侧链的体积。将天然存在的残基基于常见的侧链性质分为数组:(1)疏水性:正亮氨酸,met,ala,val,leu,ile;(2)中性亲水性:Cys,Ser,Thr,Asn,Gln;(3)酸性:asp,glu;(4)碱性:his,lys,arg;(5)影响链取向的残基:gly,pro;和(6)芳族的:trp,tyr,phe。非保守性置换需要将这些类别中之一的成员交换为另一类。一种类型的置换变体包括置换亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地,关于进一步发展所选择的得到的一种或多种变体相对于它们产生自其中的亲本抗体具有提高的生物学性质。一种产生这样的置换变体的便利方式涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简言之,对一些高变区位点(例如,6-7个位点)突变从而在每个位点产生所有可能的氨基酸置换。由此产生的抗体作为在每个颗粒中包装的与M13的基因III产物的融合体而由丝状噬菌体颗粒展示。接着如本文公开的那样筛选噬菌体展示的变体的生物学活性(例如,结合亲合力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点,可以进行丙氨酸分区诱变从而鉴定对抗原结合有显著贡献的高变区残基。备选地,或另外地,分析抗原-抗体复合体的晶体结构从而鉴定抗体和抗原之间的接触点可以是有益的。根据本文阐述的技术,所述接触残基和邻近残基是用于置换的候选物,包括在本文中阐释的那些。一旦产生了所述变体,该组变体如本文所述进行筛选,并且可以选择在一个或多个相关测定法中具有较佳性质的抗体用于进一步开发。编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子通过本领域已知的多种方法进行制备。这些方法包括,但不限于:从自然来源分离(在天然存在的氨基酸变体的情形中)或通过早期制备的抗体的变体或非变体形式的寡核苷酸-介导(或位点定向)的诱变,PCR诱变,和盒诱变进行制备。可能需要将一个或多个氨基酸修饰引入本发明的免疫球蛋白多肽的Fc区,由此产生Fc区变体。所述Fc区变体可以包含这样的人Fc区序列(例如人IgG1,IgG2,IgG3或IgG4Fc区),所述Fc区序列在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如置换),包含铰链半胱氨酸的氨基酸修饰。根据该说明书以及本领域的教导,预期在一些实施方案中,在本发明的方法中使用的抗体与野生型对应体抗体比较可以包含一个或多个改变,例如在Fc区中包含一个或多个改变。然而,这些抗体仍旧基本保留与它们的野生型对应体相同的治疗应用所需要的特征。例如,认为可以在Fc区中进行某些改变,所述改变将导致改变的(即,提高的或减少的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC),例如如在WOxa099/51642中所述。还见Duncanxa0&xa0Winter,自然(Nature)322:738-40(1988);美国专利号5,648,260;美国专利号5,624,821;和WO94/29351,其涉及Fc区变体的其它实例。WO00/42072(Presta)和WOxa02004/056312(Lowman)描述了具有提高的或减少的与FcRs结合的抗体变体。这些专利出版物的内容特别通过引用结合在本文中。还见,Shields等,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)9(2):6591-6604(2001)。在US2005/0014934A1(Hinton等)中描述了具有增加的半衰期并且对于新生儿Fc受体(FcRn)具有提高的结合的抗体,其负责将母体IgGs转移给胎儿(Guyer等,免疫学杂志(J.Immunol)117:587(1976)和Kim等,免疫学杂志(J.Immunol.)24:249(1994))。这些抗体包含在其中具有一个或多个置换的Fc区,所述置换提高Fc区与FcRn的结合。在美国专利号6,194,551B1,WO99/51642中描述了具有改变的Fc区氨基酸序列和增加的或减少的C1q结合能力的多肽变体。将这些专利出版物的内容特别通过引用结合在本文。还见,Idusogie等,免疫学杂志(J.Immunol.)164:4178-4184(2000)。抗体衍生物可以对本发明的抗体进一步修饰以包含本领域已知并且容易获得的另外的非蛋白质性的结构部分。优选地,适合抗体的衍生作用的结构部分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括,但不限于:聚乙二醇(PEG),乙二醇/丙二醇的共聚物,羧甲基纤维素,葡聚糖,聚乙烯醇,聚乙烯吡咯烷酮,聚-1,3-二氧戊环,聚-1,3,6-三噁烷,乙烯/马来酸酐共聚物,聚氨基酸(同聚物或随机共聚物),和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇,丙二醇同聚物,聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物,聚氧乙基化的多元醇(例如甘油),聚乙烯醇,及其混合物。由于其在水中的稳定性,聚乙二醇丙醛可以在生产中具有优势。聚合物可以具有任何分子量,并且可以是分支或不分支的。与抗体连接的聚合物的数目可以变化,并且如果连接多于一个聚合物,它们可以是相同或不同的分子。一般地,用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于这样的考虑来确定,所述考虑包括,但不限于,待提高的抗体的具体性质或功能,抗体衍生物是否将在限定的条件下用于治疗中等。筛选具有所需性质的抗体本发明的抗体可以通过本领域中已知的多种测定法(它们中的一些公开在本文中)来表征它们的物理/化学性质和生物学功能。在一些实施方案中,抗体关于下列中的任一种或多种进行表征:FGF(诸如FGF1和/或FGF9)结合的减少或阻断,FGFR3激活的减少或阻断,FGFR3下游分子信号传导的减少或阻断,FGFR3与配体(例如,FGF1,FGF9)结合的破坏或阻断,FGFR3二聚作用的减少或阻断,促进单体FGFR3的形成,与单体FGFR3的结合,和/或治疗和/或预防肿瘤、细胞增生性病症或癌症;和/或治疗或预防与FGFR3表达和/或活性(诸如增加的FGFR3表达和/或活性)相关的病症的。在一些实施方案中,对抗体筛选增加的FGFR3激活,增加的FGFR3下游分子信号传导,凋亡活性,FGFR3下调,和效应子功能(例如,ADCC活性)。纯化的抗体可以进一步通过一系列测定进行表征,所述测定包括,但不限于,N-末端测序,氨基酸分析,非变性尺寸排阻高压液相色谱法(HPLC),质谱法,离子交换色谱法和木瓜蛋白酶消化。在本发明的某些实施方案中,分析本文制备的抗体的生物学活性。在一些实施方案中,测试本发明的抗体的抗原结合活性。本领域已知的且可以在本文中使用的抗原结合测定法包括但不限于任何直接的或竞争性的结合测定法,所述测定法使用诸如western印迹,放射免疫测定,ELISA(酶联免疫吸附测定),“夹心”免疫测定,免疫沉淀测定,荧光免疫测定和蛋白A免疫测定的技术。示例性的抗原结合和其他测定在下面的实施例章节中提供。如果需要抑制细胞生长的抗-FGFR3抗体,则候选抗体可以在体外和/或体内测定中测试,所述测定测量对细胞生长的抑制。如果需要促进或不促进凋亡的抗-FGFR3抗体,则候选抗体可以在测量凋亡的测定中测试。用于检验癌细胞生长和/或增殖的方法,或测定癌细胞的凋亡的方法在本领域中是公知的,并且一些在本文中描述和例证。用于测定细胞生长和/或增殖和/或凋亡的示例性方法包括,例如,BrdU掺入测定,MTT,[3H]-胸苷掺入(例如,TopCount测定(PerkinElmer)),细胞活力测定(例如,CellTiter-Glo(Promega)),DNA片段化测定,胱天蛋白酶(caspase)激活测定,台盼蓝拒染(tryptanxa0bluexa0exclusion),染色质形态测定等等。在一个实施方案中,本发明设想了具有效应子功能的抗体。在某些实施方案中,测量的抗体的Fc活性。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法从而证实CDC和/或ADCC活性的减少/消除。例如,可以进行Fc受体(FcR)结合测定法从而确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性),但是保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的主要细胞,即NK细胞仅表达FcγRIII,而单核细胞表达FcγRI,FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)的第464页上的表3中总结在造血细胞上的FcR表达。评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的实例描述在美国专利号5,500,362或5,821,337中。在本文中也举例说明了一种检测ADCC活性的测定。用于所述测定法的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或另外地,目的分子的ADCC活性可以在体内评估,例如在诸如Clynes等PNAS(USA)95:652-656(1998)中公开的动物模型中评估。还可以进行C1q结合测定法从而证实抗体不能结合C1q并且因此缺乏CDC活性。为了评估补体激活,可以进行CDC测定法,例如,如在Gazzano-Santoro等,免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)202:163(1996)中所述。还可以使用本领域已知的方法,例如,实施例章节中所述的那些方法,进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定。如果需要结合单体FGFR3的抗-FGFR3抗体,则候选抗体可以在测量与单体FGFR3的结合和促进单体FGFR3形成的测定(诸如体外测定)中测试。此类测定在本领域中是已知的,并且在本文中描述和举例说明一些测定。如果需要抑制FGFR3二聚作用的抗-FGFR3抗体,则候选抗体可以在二聚作用测定中测试,例如,所述测定如本文所述和例证。在一些实施方案中,测定候选抗体的FGFR3激动剂功能。用于评估FGFR3抗体的激动剂功能或活性的方法在本领域中是已知的,并且一些也在本文中描述和例证。在一些实施方案中,测定FGFR3抗体促进FGFR3受体下调的能力,例如,使用本文描述和例证的方法进行。在一个实施方案中,FGFR3抗体与合适的测试细胞,例如,膀胱癌细胞系(例如,RT112)温育,并且在合适的时间段后,收获细胞裂解物,并检验总FGFR3水平。FACS分析也可以用来检验与候选FGFR3抗体温育后的表面FGFR3受体水平。载体、宿主细胞和重组方法为了重组产生本发明的抗体,分离编码它的核酸,并将其插入可复制载体,用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可使用常规流程容易地分离并测序编码抗体的DNA(如使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载体的选择部分取决于将要使用的宿主细胞。通常,优选的宿主细胞是原核或真核(通常是哺乳动物)来源的。要理解的是任何同种型的恒定区可以用于此目的,包括IgG,IgM,IgA,IgD,和IgE恒定区,并且这样的恒定区可以获自任何人或动物物种。a.使用原核宿主细胞产生抗体:i.载体构建可使用标准重组技术来获得编码本发明抗体的多肽成分的多核苷酸序列。可从抗体生成细胞诸如杂交瘤细胞分离期望的多核苷酸序列并测序。或者,可使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦得到,将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制并表达异源多核苷酸的重组载体。为了本发明的目的,可使用本领域可获得的且已知的许多载体。适宜载体的选择将主要取决于将要插入载体的核酸的大小和将要用该载体转化的具体宿主细胞。根据其功能(扩增或表达异源多核苷酸,或二者兼之)及其与它在其中驻留的具体宿主细胞的相容性,每种载体含有多种构件。载体构件通常包括但不限于:复制起点、选择标志基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入片段、和转录终止序列。一般而言,与宿主细胞一起使用的质粒载体包含衍生自与这些宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列。载体通常携带复制位点,以及能够在转化细胞中提供表型选择的标志序列。例如,通常用衍生自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因,由此提供轻松鉴定转化细胞的手段。pBR322、其衍生物、或其它微生物质粒或噬菌体还可包含或经修饰而包含可被微生物生物体用于表达内源蛋白质的启动子。Carter等人,美国专利号5,648,237中详细记载了用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例。另外,可将包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体用作这些宿主的转化载体。例如,可使用噬菌体诸如λGEM.TM.-11来构建可用于转化易感宿主细胞(诸如大肠杆菌LE392)的重组载体。本发明的表达载体可包含两种或多种启动子-顺反子对,它们编码每一种多肽成分。启动子是位于顺反子上游(5′)的非翻译调控序列,它调控顺反子的表达。原核启动子通常分成两类,诱导型的和组成型的。诱导型启动子指响应培养条件的变化(如营养物的存在与否或温度变化)而启动受其控制的顺反子的升高水平转录的启动子。众所周知受到多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。通过限制酶消化切下源DNA中的启动子并将分离的启动子序列插入本发明的载体,由此可将选择的启动子与编码轻链或重链的顺反子DNA可操作性连接。天然启动子序列和许多异源启动子都可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在有些实施方案中,使用异源启动子,因为与天然靶多肽启动子相比,它们通常容许所表达的靶基因的更高转录和更高产量。适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、β-半乳糖苷酶(β-galactamase)和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而,在细菌中有功能的其它启动子(诸如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也是合适的。它们的核苷酸序列已经发表,由此熟练工作人员能够使用提供任何所需限制位点的接头或衔接头将它们与编码靶轻链和重链的顺反子可操作性连接(Siebenlist等(1980)Cell(细胞)20:269)。在本发明的一个方面,重组载体内的每个顺反子都包含指导所表达的多肽穿膜转运的分泌信号序列构件。一般而言,信号序列可以是载体的构件,或者它可以是插入载体的靶多肽DNA的一部分。为了本发明而选择的信号序列应当是受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切除)的信号序列。对于不识别并加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞,将信号序列用选自例如由下列各项组成的组的原核信号序列替代:碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或热稳定的肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本发明的一个实施方案中,表达系统的两个顺反子中都使用的信号序列是STII信号序列或其变体。在另一方面,依照本发明的免疫球蛋白的生成可在宿主细胞的细胞质中发生,因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在那一点上,免疫球蛋白轻链和重链在细胞质内表达、折叠和装配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(如大肠杆菌trxB-菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件,从而容许所表达蛋白质亚基的正确折叠和装配。Proba和Pluckthunxa0Gene(基因),159:203(1995)。适于表达本发明抗体的原核宿主细胞包括古细菌(Archaebacteria)和真细菌(Eubacteria),诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用细菌的实例包括埃希氏菌属(Escherichia)(如大肠埃希氏菌(E.coli))、芽孢杆菌属(Bacilli)(如枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、肠杆菌属(Enterobacteria)、假单胞菌属物种(Pseudomonasxa0species)(如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellaxa0typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratiaxa0marcescans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、志贺氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobia)、透明颤菌属(Vitreoscilla)或副球菌属(Paracoccus)。在一个实施方案中,使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中,使用大肠杆菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110(Bachmann,Cellularxa0andxa0Molecularxa0Biology(细胞和分子生物学),vol.2(Washington,D.C.:Americanxa0Societyxa0forxa0Microbiology(美国微生物学学会),1987),第1190-1219页;ATCC保藏号27,325)及其衍生物,包括菌株33D3,其具有基因型W3110xa0ΔfhuA(ΔtonA)ptr3xa0lacxa0Iqxa0lacL8xa0ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41xa0kanR(美国专利号5,639,635)。其它菌株及其衍生物,诸如大肠杆菌294(ATCCxa031,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776(ATCCxa031,537)和大肠杆菌RV308(ATCCxa031,608)也是合适的。这些实例只是例示而非限制。本领域已知用于构建具有指定基因型的任何上述细菌衍生物的方法,并且描述在例如Bass等,Proteins(蛋白质),8:309-314(1990)中。通常必需考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适当的细菌。例如,在使用众所周知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410来提供复制子时,大肠杆菌、沙雷氏菌属(Serratia)、或沙门氏菌属(Salmonella)物种可适当的用作宿主。通常,宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶,而且可能希望在细胞培养中掺入额外的蛋白酶抑制剂。ii抗体产生用上述表达载体转化宿主细胞,并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改良的常规营养培养基中进行培养。转化意即将DNA导入原核宿主,使得DNA能够进行复制,或是作为染色体外元件或是通过染色体整合进行。根据所用的宿主细胞,使用适于这些细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理通常用于具有坚固细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的另一种技术是电穿孔。在本领域已知的且适于培养选定的宿主细胞的培养基中生长用于生成本发明多肽的原核细胞。合适培养基的实例包括添加了必需营养补充物的LB培养基(Luriaxa0broth)。在有些实施方案中,培养基还含有根据表达载体的构建而选择的选择剂,以选择性容许包含所述表达载体的原核细胞生长。例如,向用于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基中添加氨苄青霉素。除了碳、氮和无机磷酸盐来源以外,还可含有适当浓度的任何必需补充物,或是单独加入或是作为与另一种补充物或培养基的混合物,诸如复合氮源。任选的是,培养基可含有一种或多种选自下组的还原剂:谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺(cystamine)、巯基乙酸盐/酯(thioglycollate)、二硫赤藓糖醇(dithioerythritol)和二硫苏糖醇。在合适的温度培养原核宿主细胞。例如,对于培养大肠杆菌,优选温度范围为约20°C至约39°C、更优选约25°C至约37°C、甚至更优选约30°C。主要取决于宿主生物体,培养基的pH可以是范围为约5至约9的任何pH。对于大肠杆菌,pH优选约6.8至约7.4,更优选约7.0。如果本发明的表达载体中使用诱导型启动子,那么在适于激活启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面,使用PhoA启动子来控制多肽的转录。因此,为了诱导,在磷酸盐限制培养基中培养经过转化的宿主细胞。优选地,磷酸盐限制培养基是C.R.A.P培养基(参见,例如,Simmons等,J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)(2002),263:133-147)。根据所采用的载体构建体,可采用多种其它诱导物,正如本领域所知道的。在一个实施方案中,所表达的本发明的多肽分泌到宿主细胞的周质中并从中回收。蛋白质回收通常涉及破坏微生物,通常通过诸如渗透压休克、超声处理或裂解等手段。一旦细胞遭到破坏,可通过离心或过滤清除细胞碎片或整个细胞。可以通过例如亲和树脂层析进一步纯化蛋白质。或者,蛋白质可能被转运到培养液中并从中分离。可从培养液清除细胞,并且可以将培养物上清液过滤和浓缩,用于进一步纯化所生成的蛋白质。可使用普遍已知的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹测定来进一步分离和鉴定所表达的多肽。在本发明的一个方面,通过发酵过程大量进行抗体生产。多种大规模补料-分批发酵流程可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量,优选约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧和养分,尤其是葡萄糖(优选的碳源/能源)。小规模发酵通常指在体积容量不超过约100升的发酵罐中进行的发酵,范围可以是约1升至约100升。在发酵过程中,通常在将细胞在合适条件下培养至期望密度(如OD550约180-220,在此阶段细胞处于早期稳定期)后启动蛋白质表达的诱导。根据所采用的载体构建体,可使用多种诱导物,正如本领域知道的和上文描述的。可在诱导前将细胞培养较短的时间。通常将细胞诱导约12-50小时,但是可使用更长或更短的诱导时间。为了提高本发明多肽的产量和质量,可以修改多项发酵条件。例如,为了改善所分泌抗体多肽的正确装配和折叠,可使用过度表达伴侣蛋白诸如Dsb蛋白(DsbA,DsbB,DsbC,DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侣活性的一种肽基脯氨酸顺反异构酶)的另外的载体来共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中生成的异源蛋白质的正确折叠和溶解度。Chen等(1999)J.Bio.Chem.(生物化学杂志)274:19601-19605;Georgiou等,美国专利号6,083,715;Georgiou等,美国专利号6,027,888;Bothmann和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.(生物化学杂志)275:17100-17105;Ramm和Pluckthun(2000)J.Biol.Chem.(生物化学杂志)275:17106-17113;Arie等,(2001)Mol.Microbiol.(分子微生物学)39:199-210。为了将所表达异源蛋白质(尤其是对蛋白水解敏感的异源蛋白质)的蛋白水解降至最低,可将蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本发明。例如,可修饰宿主细胞菌株,在编码已知细菌蛋白酶的基因中进行遗传突变,所述细菌蛋白酶诸如蛋白酶III,OmpT,DegP,Tsp,蛋白酶I,蛋白酶Mi,蛋白酶V,蛋白酶VI,及其组合。可以获得一些大肠杆菌蛋白酶缺陷型菌株,例如,在Joly等(1998),见上文;Georgiou等,美国专利号5,264,365;Georgiou等,美国专利号5,508,192;Hara等,Microbialxa0Drugxa0Resistance(微生物耐药性),2:63-72(1996)中所述。在一个实施方案中,使用蛋白水解酶缺陷且用过表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株作为在本发明的表达系统中的宿主细胞。iii.抗体纯化可采用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。下面的流程是合适纯化流程的例示:免疫亲和或离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、和使用例如Sephadexxa0G-75的凝胶过滤。在一个方面,将固定在固相上的蛋白A用于本发明全长抗体产物的免疫亲和纯化。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusxa0aureas)的41kD细胞壁蛋白质,它以高亲合力结合抗体Fc区。Lindmark等(1983)J.Immunol.Meth.(免疫学方法杂志)62:1-13。蛋白A固定其上的固相优选是具有玻璃或硅石表面的柱子,更优选是可控孔径玻璃柱或硅酸柱。在有些应用中,柱子以诸如甘油等试剂包被,试图防止污染物的非特异粘附。作为纯化的第一个步骤,来源于如上所述的细胞培养物的制剂应用到固定有蛋白A的固相上从而允许目的抗体与蛋白A的特异性结合。然后清洗固相以清除与固相非特异结合的污染物。最后通过洗脱从固相回收目的抗体。b.使用真核宿主细胞产生抗体:载体构件通常包括但不限于如下一种或多种:信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、转录终止序列。(i)信号序列构件在真核宿主细胞中使用的载体还可以包含信号序列或在成熟的目的蛋白质或多肽的N端处具有特异切割位点的其它多肽。优选选择的异源信号序列是受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切除)的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中,可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列,例如单纯疱疹病毒gD信号。将这些前体区的DNA连接到编码抗体的DNA的阅读框中。(ii)复制起点通常,哺乳动物表达载体不需要复制起始点构件。例如,典型地可以使用SV40起点,这只是因为其包含早期启动子。(iii)选择基因构件表达和克隆载体可包含选择基因,也称为可选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质:(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性,如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素;(b)在相关时,补充营养缺陷性缺陷;或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物。选择方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。经异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质,因而幸免于选择方案。此类显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸(mycophenolicxa0acid)和潮霉素。适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个实例是能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的选择标志,诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白I和II,优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。例如,首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx,DHFR的一种竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时,适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如ATCCxa0CRL-9096)。或者,可通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素(如卡那霉素、新霉素或G418)的培养基中培养细胞来选择用编码抗体、野生型DHFR蛋白、和另一种选择标志(诸如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH))的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参见美国专利号4,965,199。(iv)启动子构件表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子,且与抗体多肽核酸可操作连接。用于真核细胞的启动子序列是已知的。事实上,所有真核基因都具有富含AT区,它位于起始转录的位点上游约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一种序列是CNCAAT区,其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′端是AATAAA序列,它可能是向编码序列的3′端添加聚腺苷酸(polyA)尾的信号。所有这些序列合适地插入至真核表达载体中。在哺乳动物宿主细胞中由载体转录抗体多肽受到例如从病毒(诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如2型腺病毒)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒、和猿猴病毒40(SV40))基因组获得的启动子、来自异源哺乳动物启动子(如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)、来自热休克启动子的启动子的控制,条件是这些启动子与宿主细胞系统相容。方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子,该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIIIxa0E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的即时早期启动子。美国专利号4,419,446中公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利号4,601,978中记载了该系统的修改。备选地,可使用劳氏肉瘤病毒长末端重复作为启动子。(v)增强子元件构件常常通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核生物对编码本发明抗体多肽的DNA的转录。现在已知来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而,通常使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括SV40复制起点晚期侧的增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv,Nature(自然)297:17-18(1982)。增强子可剪接到载体中,位于抗体多肽编码序列的5′或3′位置,但是优选位于启动子的5′位点。(vi)转录终止构件典型地,在真核宿主细胞中使用的表达载体还包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的非翻译区的5′端和偶尔的3′端获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译区中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026及其中公开的表达载体。(vii)宿主细胞的选择和转化适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括本文描述的高等真核细胞,包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已经成为常规流程。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例有经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7,ATCCxa0CRLxa01651);人胚肾系(293细胞或为悬浮培养生长而亚克隆的293细胞,Graham等,J.Gen.Virol.(遗传病毒学杂志)36:59(1977));幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCCxa0CCLxa010);中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)77:4216(1980));小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980));猴肾细胞(CV1,ATCCxa0CCLxa070);非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCCxa0CRLxa01587);人宫颈癌细胞(HELA,ATCCxa0CCLxa02);犬肾细胞(MDCK,ATCCxa0CCLxa034);布法罗鼠(buffaloxa0rat)肝细胞(BRLxa03A,ATCCxa0CRLxa01442);人肺细胞(W138,ATCCxa0CCLxa075);人肝细胞(Hepxa0G2,HBxa08065);小鼠乳瘤(MMTxa0060562,ATCCxa0CCLxa051);TRI细胞(Mather等,Annalsxa0N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982));MRCxa05细胞;FS4细胞;和人肝细胞瘤(hepatoma)系(Hepxa0G2)。为了生成抗体,用上文所述表达载体或克隆载体转化宿主细胞,并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改良的常规营养培养基中进行培养。(viii)宿主细胞的培养可在多种培养基中培养用于生成本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham’sxa0F10(Sigma)、极限必需培养基((MEM),Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco改良Eagle培养基((DMEM),Sigma)适于培养宿主细胞。另外,可使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基:Ham等,Meth.Enz.(酶学方法)58:44(1979),Barnes等,Anal.Biochem.(分析生物化学)102:255(1980),美国专利号4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;或5,122,469;WOxa090/03430;WOxa087/00195;或美国再颁专利30,985。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCIN^TM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以适宜浓度含有本领域技术人员已知的任何其它必需补充物。培养条件诸如温度、pH等即为表达而选择的宿主细胞先前所用的培养条件,这对于普通技术人员是显而易见的。(ix)抗体的纯化在使用重组技术时,抗体可在细胞内生成,或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体,那么首先需要通过例如离心或超滤清除微粒碎片,即宿主细胞或裂解片段。如果抗体分泌到培养基中,那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或Milliporexa0Pellicon超滤部件)浓缩来自这些表达系统的上清液。可在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解,而且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。可使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化从细胞制备的抗体组合物,亲和层析是优选的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等,J.Immunol.Meth.(免疫学方法杂志)62:1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等,EMBOxa0J.5:15671575(1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖,但是可使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯能获得比琼脂糖更快的流速和更短的处理时间。若抗体包含CH3结构域,则可使用Bakerbondxa0ABX^TM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)进行纯化。根据待回收的抗体,也可使用其它蛋白质纯化技术诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSE^TM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。在任何初步纯化步骤之后,可将含有目的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析,使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液,优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)进行。免疫缀合物本发明还提供免疫缀合物(可互换地称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”),其包含与细胞毒性剂缀合的本文所述的任一种抗FGFR3抗体,所述细胞毒性剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射缀合物)。在癌症治疗中,用于局部递送细胞毒性剂或细胞生长抑制剂(即杀死或抑制肿瘤细胞的药物)的抗体-药物缀合物的使用(Syrigos和Epenetos(1999)Anticancerxa0Researchy(抗癌研究)19:605-614;Niculescu-Duvazxa0andSpringer(1997)Adv.Drg.Del.Rev.26:151-172;美国专利号4,975,278)允许将药物部分靶向递送至肿瘤,并在其中细胞内积累,而这些未经缀合的药剂的全身施用可导致对正常细胞以及试图消除的肿瘤细胞的不可接受的毒性水平(Baldwin等,(1986)Lancet(柳叶刀)pp.(1986年3月15日):603-05;Thorpe,(1985)“Antibodyxa0Carriersxa0Ofxa0Cytotoxicxa0Agentsxa0InCancerxa0Therapy:AReview(肿瘤治疗中细胞毒性剂的抗体载体:综述),”在Monoclonalxa0Antibodies′84:Biologicalxa0Andxa0Clinicalxa0Applications(单克隆抗体′84:生物学和临床应用),A.Pinchera等编辑,第475-506页中)。由此寻求最大功效且具有最小毒性。多克隆抗体和单克隆抗体皆有报道可用于这些策略(Rowland等,(1986)Cancerxa0Immunol.Immunother.(癌症免疫学和免疫疗法),21:183-87)。这些方法中所使用的药物包括道诺霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和长春地辛(vindesine)(Rowland等,1986,见上文)。抗体-毒素缀合物中所使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、植物毒素诸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素诸如格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler等(2000)Jour.ofxa0thexa0Nat.CancerInst.(国家癌症研究所杂志)92(19):1573-1581;Mandler等,(2000)Bioorganic&Med.Chem.Letters(生物有机和医学化学通讯)10:1025-1028;Mandler等,(2002)Bioconjugatexa0Chem.(生物缀合化学)13:786-791),美登木素生物碱类(maytansinoids)(EPxa01391213;Liu等,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院学报)93:8618-8623),和加利车霉素(calicheamicin)(Lode等,(1998)Cancerxa0Res.(癌症研究)58:2928;Hinman等,(1993)Cancerxa0Res.(癌症研究)53:3336-3342)。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制的机制影响其细胞毒性和细胞生长抑制作用。有些细胞毒性药物在与大的抗体或蛋白质受体配体缀合时趋于失活或活性降低。ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="286"/>(替伊莫单抗(ibritumomabxa0tiuxetan),Biogen/Idec)是由针对在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgG1κ单克隆抗体与通过硫脲接头-螯合剂所结合的¹¹¹In或⁹⁰Y放射性同位素构成的抗体-放射性同位素缀合物(Wiseman等,(2000)Eur.Jour.Nucl.Med.27(7):766-77;Wiseman等,(2002)Blood(血液)99(12):4336-42;Witzig等,(2002)J.Clin.Oncol.(临床肿瘤学杂志)20(10):2453-63;Witzig等,(2002)J.Clin.Oncol.(临床肿瘤学杂志)20(15):3262-69)。尽管ZevalIN具有针对B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)的活性,然而施药在大多数患者中导致严重且长时间的血细胞减少。MYLOTARG^TM(吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumabxa0ozogamicin),Wyethxa0Pharmaceuticals),即由huxa0CD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体-药物缀合物,在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病(Drugsxa0ofxa0thexa0Future(未来药物)(2000)25(7):686;美国专利号4,970,198;5,079,233;5,585,089;5,606,040;5,6937,62;5,739,116;5,767,285;5,773,001)。美坎珠单抗(Cantuzumabxa0mertansine)(Immunogen,Inc.),即由huC242抗体经二硫化物接头SPP与美登木素生物碱类药物结构部分DM1连接而构成的抗体药物缀合物,正在进行用于治疗表达CanAg的癌症诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌的II期试验。MLN-2704(Millenniumxa0Pharm.,BZLxa0Biologics,Immunogenxa0Inc.),即由抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物碱类药物结构部分DM1连接而构成的抗体药物缀合物,正在进行用于前列腺肿瘤潜在治疗的开发。将多拉司他汀(dolastatin)的合成类似物auristatin肽,即auristatinxa0E(AE)和单甲基auristatin(MMAE)与嵌合单克隆抗体cBR96(对癌上的Lewisxa0Y特异)和cAC10(对恶性血液肿瘤上的CD30特异)缀合(Doronina等,(2003)Naturexa0Biotechnology.(自然生物技术)21(7):778-784),且正在进行治疗性开发。本文(例如上文)描述了可用于生成此类免疫缀合物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasxa0aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(α-sarcin)、油桐(Aleutitesxa0fordii)蛋白、香石竹毒蛋白(dianthinprotein)、美洲商陆(Phytolacaxa0americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicaxa0charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonariaxa0officinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公开的WOxa093/21232。多种放射性核素可用于生成放射缀合抗体。实例包括²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、⁹⁰Y、和¹⁸⁶Re。抗体和细胞毒性剂的缀合物可使用多种双官能蛋白质偶联剂来制备,诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(iminothiolane)(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(诸如二甲基己二亚酰胺盐酸化物(dimethylxa0adipimidatexa0HCl))、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如,可如Vitetta等,Science(科学)238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的例示性螯合剂。参见WOxa094/11026。本文还设想了抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱类(maytansinoids)、多拉司他汀(dolastatins)、aurostatins、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065及这些毒素具有毒素活性的片段的缀合物。i.美登素(Maytansine)和美登木素生物碱类在一些实施方案中,免疫缀合物包含与一个或多个美登木素生物碱类分子缀合的本发明的抗体(全长或片段)。美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenusxa0serrata)分离得到(美国专利号3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类,诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利号4,151,042)。例如下列美国专利公开了合成的美登醇及其衍生物和类似物:Nos.4,137,230;4,248,870;4,256,746;4,260,608;4,265,814;4,294,757;4,307,016;4,308,268;4,308,269;4,309,428;4,313,946;4,315,929;4,317,821;4,322,348;4,331,598;4,361,650;4,364,866;4,424,219;4,450,254;4,362,663;和4,371,533。在抗体药物缀合物中,美登木素生物碱类药物结构部分是有吸引力的药物结构部分,因为它们:(i)相对易于通过发酵或化学修饰、从发酵产物衍生而制备,(ii)易于用适于通过非二硫化物接头缀合至抗体的官能团衍生化,(iii)在血浆中稳定,和(iv)针对多种肿瘤细胞系有效。已经公开了含有美登木素生物碱类的免疫缀合物、其制备方法及其治疗用途,例如,公开在美国专利Nos.5,208,020,5,416,064及欧洲专利EP0425235B1中,明确将其公开内容通过引用并入本文。Liu等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)93:8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱类的免疫缀合物。发现该缀合物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性,而且在体内肿瘤生长测定法中显示抗肿瘤活性。Chari等,CancerResearch(癌症研究)52:127-131(1992)记载了其中美登木素生物碱类经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1缀合的免疫缀合物。在体外在人乳癌细胞系SK-BR-3上测试了TA.1-美登木素生物碱类缀合物的细胞毒性,该细胞系每个细胞表达3x10⁵个HER-2表面抗原。药物缀合物达到了与游离美登木素生物碱类药物相似的一定程度的细胞毒性,这可通过增加每个抗体分子缀合的美登木素生物碱类分子数目来提高。A7-美登木素生物碱类缀合物在小鼠中显示低系统性细胞毒性。抗体-美登木素生物碱类缀合物可通过将抗体与美登木素生物碱类分子化学连接且不显著削弱抗体或美登木素生物碱类分子的生物学活性来制备。参见例如,美国专利No.5,208,020(其公开内容通过引用明确并入本文)。每个抗体分子缀合平均3-4个美登木素生物碱类分子已在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效,且对抗体的功能或溶解度没有负面影响,尽管预计甚至一个分子的毒素/抗体也将较之使用裸抗体而增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域是众所周知的,而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木素生物碱类。优选的美登木素生物碱类是美登醇和在美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物,诸如各种美登醇酯。本领域已知许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱类缀合物,包括例如美国专利No.5,208,020或欧洲专利0425235B1,Chari等,Cancerxa0Research(癌症研究)52:127-131(1992),和2004年10月8日提交的美国专利申请No.10/960,602中所公开的,其公开内容通过引用明确并入本文。可如2004年10月8日提交的美国专利申请No.10/960,602所公开的制备包含接头成分SMCC的抗体-美登木素生物碱类缀合物。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团,正如上文所述专利中所公开的,二硫化物和硫醚基团是优选的。另外的连接基团在本文进行了描述和例示。可使用多种双官能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱类的缀合物,诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(诸如二甲基己二亚酰胺盐酸化物)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等,Biochem.J.(生物化学杂志)173:723-737(1978))和N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP),从而提供二硫键连接。根据连接的类型,可将接头连接于美登木素生物碱类分子的多个位置。例如,可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选实施方案中,在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成连接键。ii.Auristatin和多拉司他汀在一些实施方案中,免疫缀合物包含与多拉司他汀(dolastatin)或多拉司他汀肽类似物和衍生物,auristatins缀合的本发明的抗体(美国专利Nos.5,635,483和5,780,588)。多拉司他汀类和auristatins已经显示出干扰微管动力学、GTP水解、及核和细胞分裂(Woyke等(2001)Antimicrob.Agentsandxa0Chemother.(抗微生物剂和化疗)45(12):3580-3584)且具有抗癌(U.S.专利号5,663,149)和抗真菌活性(Pettit等,(1998)Antimicrob.AgentsChemother.(抗微生物剂和化疗)42:2961-2965)。多拉司他汀或auristatin药物结构部分可经由肽药物结构部分的N(氨基)末端或C(羧基)末端连接于抗体(WOxa002/088172)。例示性的auristatin实施方案包括N-末端连接的单甲基auristatin药物结构部分DE和DF,披露于2004年11月5日提交的“MonomethylvalineCompoundsxa0Capablexa0ofxa0Conjugationxa0toxa0Ligands(能缀合至配体的单甲基缬氨酸化合物)”,美国序列号10/983,340,通过引用明确将其公开内容完整合并入本文。典型的是,基于肽的药物结构部分可通过在两个或多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。此类肽键可依照例如肽化学领域众所周知的液相合成法来制备(参见E.ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="206"/>和K.Lübke,“Thexa0Peptides(肽),”第1卷,第76-136页,1965,Academicxa0Press)。Auristatin/多拉司他汀药物结构部分可依照以下文献中的方法来制备:U.S.专利号5,635,483和5,780,588;Pettit等,(1989)J.Am.Chem.Soc.(美国化学学会杂志)111:5463-5465;Pettit等,(1998)Anti-Cancerxa0Drugxa0Design(抗癌药物设计)13:243-277;Pettit,G.R.,等,Synthesis(合成),1996,719-725;和Pettit等,(1996)J.Chem.Soc.Perkinxa0Trans.15:859-863。也见Doronina(2003)Nat.Biotechnol.(自然:生物技术)21(7):778-784;“MonomethylvalineCompoundsxa0Capablexa0ofxa0Conjugationxa0toxa0Ligands(能缀合至配体的单甲基缬氨酸化合物)”,2004年11月5日提交的美国序列号No.10/983,340,,将其通过引用完整收入本文(披露了例如制备缀合至接头的单甲基缬氨酸化合物(诸如MMAE和MMAF)的接头和方法)。iii.加利车霉素在其它实施方案中,免疫缀合物包含与一个或多个加利车霉素分子缀合的本发明的抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。关于加利车霉素家族缀合物的制备参见美国专利号5,712,374,5,714,586,5,739,116,5,767,285,5,770,701,5,770,710,5,773,001,和5,877,296(都属于Americanxa0Cyanamidxa0Company)。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ₁^I,α₂^I,α₃^I,N-乙酰基-γ₁^I,PSAG和θ^I₁(Hinman等,Cancerxa0Research(癌症研究)53:3336-3342(1993),Lode等,Cancerxa0Research(癌症研究)58:2925-2928(1998);及上述属于Americanxa0Cyanamid的美国专利)。可与抗体缀合的另一种抗肿瘤药物是QFA,它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点,且不易穿过质膜。因此,这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒性效果。iv.其它细胞毒性剂可与本发明的抗体缀合的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱(vincristine)和5-氟尿嘧啶、美国专利号5,053,394和5,770,710记载的统称为LL-E33288复合体的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)(美国专利号5,877,296)。可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(α-sarcin)、油桐(Aleutitesxa0fordii)蛋白、香石竹毒蛋白(dianthinxa0protein)、美洲商陆(Phytolacaxa0americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonariaxa0officinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公开的WO93/21232。本发明还考虑了以下免疫缀合物,其在抗体和具有核酸降解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶,诸如脱氧核糖核酸酶;DNA酶)之间形成。为了选择性破坏肿瘤,抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射缀合的抗体。实例包括At²¹¹,I¹³¹,I¹²⁵,Y⁹⁰,Re¹⁸⁶,Re¹⁸⁸,Sm¹⁵³,Bi²¹²,P³²,Pb²¹²和Lu的放射性同位素。在将缀合物用于检测时,可包含用于闪烁照相研究的放射性原子,例如tc^99m或I¹²³,或是包含用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像,mri)的自旋标记物,诸如同样是碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。可以已知方式将放射性或其它标记物掺入缀合物。例如,可生物合成肽,或是通过化学氨基酸合成法合成肽,其中使用包括例如氟-19代替氢的合适的氨基酸前体。可经肽中的半胱氨酸残基来连接标记物,诸如tc^99m或I¹²³,Re¹⁸⁶,Re¹⁸⁸和In¹¹¹。可以经赖氨酸残基来连接钇-90。IODOGEN法(Fraker等(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.(生物化学和生物物理学研究通讯)80:49-57)可用于掺入碘-123。“MonoclonalAntibodiesxa0inImmunoscintigraphy(免疫闪烁成像中的单克隆抗体)”(Chatal,CRCxa0Press1989)详细记载了其它方法。抗体和细胞毒性剂的缀合物可使用多种双官能蛋白质偶联剂来制备,诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(诸如二甲基己二亚酰胺盐酸化物)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如,可如Vitetta等,Science(科学)238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的例示性螯合剂。参见WOxa094/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如,可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物的接头(Chari等,Cancerxa0Research(癌症研究)52:127-131(1992);美国专利No.5,208,020)。本发明的化合物明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的ADC:商品化(如购自Piercexa0Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,美国)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC、和硫代-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。见2003-2004年度应用手册和产品目录(Applicationsxa0Handbookxa0andxa0Catalog)第467-498页。v.抗体药物缀合物的制备在本发明的抗体药物缀合物(ADC)中,将抗体(Ab)经接头(L)与一个或多个药物结构部分(D)缀合,例如每个抗体缀合约1个至约20个药物结构部分。可采用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC,包括:(1)抗体的亲核基团与二价接头试剂反应,以通过共价键形成Ab-L,随后与药物结构部分D反应;和(2)药物结构部分的亲核基团与二价接头试剂反应,以通过共价键形成D-L,随后与抗体的亲核基团反应。本文描述了用于制备ADC的另外的方法。Ab-(L-D)_pxa0xa0xa0xa0I接头可由一个或多个接头构件构成。示例性接头构件包括6-马来酰亚胺己酰基(6-maleimidocaproyl,“MC”)、马来酰亚胺基丙酰基(maleimidopropanoyl,“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对-氨基苯甲氧基羰基(p-aminobenzyloxycarbonyl,“PAB”)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯(“SMCC’)、和N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)。另外的接头构件是本领域已知的,有些在本文进行了描述。也见“Monomethylvalinexa0Compoundsxa0Capablexa0ofConjugationxa0toxa0Ligands(能缀合至配体的单甲基缬氨酸化合物),”2004年11月5日提交的美国序列号No.10/983,340,其全文内容通过引用并入本文。在一些实施方案中,接头可包含氨基酸残基。示例性的氨基酸接头构件包括二肽、三肽、四肽、或五肽。示例性的二肽包括:缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)。示例性的三肽包括:甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。包含氨基酸接头构件的氨基酸残基包括天然存在的那些,以及稀有氨基酸(minorxa0aminoxa0acid)和非天然存在的氨基酸类似物,如瓜氨酸。可以设计氨基酸接头构件并且最优化其选择性以用于通过特定的酶(如肿瘤相关的蛋白酶,组织蛋白酶B、C和D,或纤溶酶蛋白酶)进行酶切割。抗体上的亲核基团包括但不限于:(i)N末端胺基;(ii)侧链胺基,如赖氨酸;(iii)侧链巯基,如半胱氨酸;和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。胺基、巯基、和羟基是亲核的,能够与接头结构部分和接头试剂上的亲电子基团反应而形成共价键,而接头结构部分和接头试剂包括:(i)活性酯类,诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物;(ii)烷基和苯甲基卤化物,诸如卤代乙酰胺;(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键,即半胱氨酸桥。可通过用还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)处理使抗体具有与接头试剂缀合的反应活性。每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。可经由赖氨酸与2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)的反应,导致胺转变为硫醇,从而将额外的亲核基团引入抗体。通过引入一个、两个、三个、四个、或更多半胱氨酸残基(例如制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变抗体)可将反应性巯基引入抗体。还可通过修饰抗体引入可与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子结构部分来生成本发明的抗体药物缀合物。可用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖,从而形成可与接头试剂或药物结构部分的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺希夫碱基可形成稳定的连接键,或者可用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接键。在一个实施方案中,糖基化抗体的糖部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中生成羰(醛和酮)基团,它可与药物上的适当基团反应(Hermanson,BioconjugateTechniques)。在另一个实施方案中,包含N末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可与偏高碘酸钠反应,导致在第一个氨基酸处生成醛(Geoghegan&Stroh,(1992)Bioconjugatexa0Chem.(生物缀合物化学)3:138-146;U.S.专利号5,362,852)。此类醛可与药物结构部分或接头亲核体反应。同样,药物结构部分上的亲核基团包括但不限于:胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲(thiosemicarbazone)、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团,它们能够与接头部分和接头试剂上的亲电子基团反应而形成共价键,而接头部分和接头试剂包括:(i)活性酯类,诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物;(ii)烷基和苯甲基卤化物,诸如卤代乙酰胺;(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。或者,可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒性剂的融合蛋白。DNA的长度可包含各自编码缀合物两个部分的区域,其或彼此毗邻或由编码接头肽的区域分开,该接头肽不破坏缀合物的期望特性。在又一个实施方案中,可将抗体与“受体”(诸如链霉抗生物素蛋白)缀合从而用于肿瘤预先靶向,其中对个体施用抗体-受体缀合物,接着使用清除剂由循环中清除未结合的缀合物,然后施用与细胞毒性剂(如放射性核苷酸)缀合的“配体”(如抗生物素蛋白)。使用抗-FGFR3抗体的方法本发明的特征在于将FGFR3抗体用作具体治疗方案的一部分,所述治疗方案预期由该治疗剂提供有益的作用。本发明尤其可用于治疗处于各种阶段的各种类型的癌症。术语癌症包括一组增殖性病症,包括但不限于癌前生长、良性肿瘤、和恶性肿瘤。良性肿瘤维持局限在原始位点并且没有浸润、侵袭或转移至远端位点的能力。恶性肿瘤将侵袭并破坏其周围的其它组织。它们也获得了从原始位点剥离并扩散至身体其它部分的能力(转移),通常通过血流或通过淋巴结所在的淋巴系统转移。原发肿瘤通过它们所发生的组织类型进行分类;转移瘤通过癌细胞所来源的组织类型进行分类。经过一段时间,恶性肿瘤的细胞变得更加异常并显得更不像正常细胞。这种癌细胞的外观变化称为肿瘤分级,并且癌细胞被描述为良好分化的(低级别(lowxa0grade))、中度分化的、较差分化的或未分化的(高级别(highxa0grade))。良好分化的细胞显得非常正常并且类似于它们所来源的正常细胞。未分化的细胞是变得如此异常以至于不能确定该细胞的来源的细胞。癌症分期系统描述了癌症在解剖学上扩散多远并试图将具有相似预后和治疗的患者放在相同的分期组中。可进行数种测试以协助进行癌症分期,包括组织活检和某些显影测试如胸部X线、乳房X线照片、骨扫描、CT扫描和MRI扫描。还使用血液测试和临床评价来评价患者的总体健康并检测癌症是否扩散到某些器官。为对癌症分期,美国癌症联合委员会(Americanxa0Jointxa0Committeexa0onCancer)首次使用TNM分类系统将癌症特别是实体瘤以字母类别排列。癌症被指定为字母T(肿瘤大小)、N(可触及淋巴结)、和/或M(转移)。T1,T2,T3,和T4描述了原发损害的大小增加;N0,N1,N2,N3表明涉及淋巴结的进行性进展;M0和M1反映了远端转移的不存在或存在。在第二种分期方法中,也已知为总体分期分组(Overallxa0Stagexa0Grouping)或罗马数字分期(Romanxa0Numeralxa0Staging),癌症被分为0至IV期,包括原发损害的大小以及淋巴结扩散和远端转移的存在。在这种系统中,病例分组到由罗马数字I到IV表示的四个期,或分类为“复发”。对一些癌症,0期被称为“原位”或“Tis”,如对于乳腺癌的原位导管癌或原位小叶癌。高级别腺瘤也可分类为0期。一般而言,I期癌症是通常可治愈的小的局限性癌症,而IV期通常代表不可手术或转移的癌症。II期和III期癌症通常是局部进展和/或表现出局部淋巴结的参与。一般而言,更高分期数字表示更大面积的疾病,包括更大的肿瘤大小和/或癌症扩散到附近淋巴结和/或原发肿瘤邻近的器官。这些分期是精确定义的,但该定义对每种癌症不同并且是本领域技术人员已知的。许多癌症登记,诸如国立癌症研究所的监测、流行病学和远期结果计划(NCI’sxa0Surveillance,Epidemiology,andxa0Endxa0Resultsxa0Program(SEER))使用概括分期(summaryxa0staging)。这种系统用于所有类型的癌症。它将癌症病例分成五个主要类型的组:原位(Inxa0situ)是早期癌,其仅在其发生的细胞层中存在。局部(Localized)是局限于其发生的器官的癌症,无扩散迹象。区域(Regional)是已经从最初(原发)位点扩散到附近淋巴结或器官和组织的癌症。远处(Distant)是已经从原发位点扩散到远处器官或远处淋巴结的癌症。未知(Unknown)用于描述对于该病例没有足够的信息表明分期的病例。此外,癌症通常在原发肿瘤已经去除后数个月或数年复发。在所有可见的肿瘤切除后癌症复发称为复发性疾病。在原发肿瘤区域复发的疾病是局部复发,作为转移复发的疾病称为远端复发。肿瘤可以是实体瘤或非实体瘤或软组织肿瘤。软组织肿瘤的实例包括白血病(例如,慢性髓细胞性白血病(chronicxa0myelogenousxa0leukemia)、急性髓细胞性白血病(acutexa0myelogenousxa0leukemia)、成人急性淋巴细胞白血病(adultxa0acutexa0lymphoblasticxa0leukemia)、急性髓性白血病(acutexa0myelogenousleukemia)、成熟B细胞急性淋巴细胞白血病(maturexa0B-cellxa0acutelymphoblasticxa0leukemia)、慢性淋巴细胞白血病(chronicxa0lymphocyticleukemia)、polymphocytic白血病(polymphocyticxa0leukemia)、或毛细胞白血病(hairyxa0cellxa0leukemia))或淋巴瘤(lymphoma)(例如,非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin′sxa0lymphoma)、皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneousxa0T-celllymphoma)、或霍奇森病(Hodgkin′sxa0disease))。实体瘤包括除血液、骨髓、或淋巴系统之外的任何身体组织的癌症。实体瘤可进一步分为上皮细胞来源的那些和非上皮细胞来源的那些。上皮细胞实体瘤的实例包括胃肠道、结肠、乳腺、前列腺、肺、肾、肝、胰腺、卵巢、头和颈、口腔、胃、十二指肠、小肠、大肠、肛门、胆囊、阴唇、鼻咽、皮肤、子宫、男性生殖器、泌尿器官、膀胱及皮肤的肿瘤。非上皮来源的实体瘤包括肉瘤(sarcomas)、脑肿瘤(brainxa0tumors)、和骨肿瘤(bonexa0tumors)。肿瘤的其他实例描述在定义章节中。在一些实施方案中,对本文的患者进行诊断测试,例如在治疗前和/或治疗中和/或治疗后。一般而言,如果进行诊断测试,可从需要治疗的患者获得样品。当受试者患有癌症时,该样品可以是肿瘤样品,或其它生物学样品,如生物学液体,包括但不限于血液、尿液、唾液、腹水或衍生物如血清和血浆等等。本文的生物学样品可以是固定的样品,例如福尔马林固定的、石蜡包埋(FFPE)的样品或冷冻的样品。用于测定mRNA或蛋白质表达的方法有多种,包括但不限于基因表达谱、聚合酶链式反应(PCR)(包括定量实时-PCR(qRT-PCR))、微阵列分析、基因表达系列分析(serialxa0analysisxa0ofxa0genexa0expression,SAGE)、MassARRAY、通过大量平行签名测序(Massivexa0Parallelxa0SignitureSequencing,MPSS)进行的基因表达分析、蛋白质组学、免疫组化(IHC)等。优选对mRNA定量。所述mRNA分析优选使用聚合酶链式反应(PCR)技术或通过微阵列分析来进行。若采用PCR,则优选的PCR形式是定量实时PCR(qRT-PCR)。在一个实施方案中,如果上文提到的一种或多种基因的表达处于中值或高于中值,例如与相同肿瘤类型的其它样品相比,那么认为其是阳性表达。可以在与测量基因表达的同时测定中值表达水平,或者可以事先测定。多篇已发表的期刊论文(例如Godfrey等J.Molec.Diagnostics(分子诊断杂志)2:84-91(2000);Specht等,Am.J.Pathol.(美国病理学杂志)158:419-29(2001))中给出了使用固定的、石蜡包埋的组织作为RNA来源的代表性基因表达概况分析方案的步骤:包括mRNA分离、纯化、引物延伸和扩增。简单的说,一种代表性方法首先将石蜡包埋的肿瘤组织样品切成约10微米厚的切片。然后提取RNA并除去蛋白质和DNA。分析RNA浓度后,如果需要可以包括RNA修复和/或扩增步骤,并使用基因特异性启动子逆转录RNA,然后PCR。最后分析数据,根据所检验肿瘤样品中鉴定的特征性基因表达模式来确定患者可用的最佳治疗选项。基因或蛋白表达的检测可以直接或间接确定。人们可以测定癌症中的FGFR3的表达或易位或扩增(直接地或间接地测定)。对此,可利用多种诊断/预后测定法。在一个实施方案中,可通过IHC来分析FGFR3的过表达。可将来自肿瘤组织活检的石蜡包埋组织切片进行IHC测定法并对照如下FGFR3蛋白质染色强度标准:得分0:未观察到染色或者在少于10%的肿瘤细胞中观察到膜染色。得分1+:在超过10%的肿瘤细胞中检测到微弱的/刚刚可察觉的膜染色。所述细胞只在其部分膜中有染色。得分2+:在超过10%的肿瘤细胞中观察到微弱至中等的完全膜染色。得分3+:在超过10%的肿瘤细胞中观察到中等至强烈的完全膜染色。在一些实施方案中,那些FGFR3过表达评估得分为0或1+的肿瘤可表征为未过表达FGFR3,而那些得分为2+或3+的肿瘤可表征为过表达FGFR3。在一些实施方案中,过表达FGFR3的肿瘤可根据对应于每个细胞表达的FGFR3分子拷贝数的免疫组化得分进行定级,并且可通过生化方法测定:0=0-90个拷贝/细胞,1+=至少约100个拷贝/细胞,2+=至少约1000个拷贝/细胞,3+=至少约10,000个拷贝/细胞。备选地,或另外地,可对福尔马林固定、石蜡包埋的肿瘤组织进行FISH测定法来测定肿瘤中FGFR3扩增或易位的存在或和/或程度(如果有的话)。FGFR3激活可直接测定(例如通过磷酸-ELISA测试或其它检测磷酸化受体的方法)或间接测定(例如通过检测激活的下游信号传导途径组分,检测受体二聚物(例如同二聚体、异二聚体),检测基因表达概况等)。相似地,组成型FGFR3和/或配体不依赖性或配体依赖性的FGFR3可直接或间接检测(例如通过检测与组成型活性相关的受体突变、通过检测与组成型活性相关的受体扩增等)。检测核酸突变的方法是本领域公知的。通常,尽管不是必需的,扩增样品中的靶核酸以提供所希望的材料量,来确定是否存在突变。扩增技术是本领域公知的。例如,扩增产物可以涵盖或不涵盖所有编码目的蛋白质的核酸序列,只要该扩增产物包含怀疑突变所在的特定氨基酸/核酸序列位置。在一个实施例中,可以通过将来自样品的核酸与能够与编码突变核酸的核酸特异性杂交的核酸探针接触,并检测所述杂交,由此确定突变的存在。在一个实施方案中,探针被可检测的标记,例如用放射性同位素(³H,³²P,³³P等)、荧光剂(若丹明、荧光素等)或发色剂标记。在一些实施方案中,探针是反义寡聚物,例如PNA、吗啉代-氨基磷酸酯、LNA或2′-烷氧基烷氧基。探针可以有约8个核苷酸至约100个核苷酸、或约10个至约75个、或约15个至约50个、或约20个至约30个。在另一个方面,本发明的核酸探针提供在试剂盒中,用以鉴定样品中的FGFR3突变,所述试剂盒包含特异杂交于或邻近于编码FGFR3的核酸中的突变位点的寡核苷酸。试剂盒可进一步包括根据使用试剂盒的杂交测试的结果,用FGFR3拮抗剂治疗患包含FGFR3突变的肿瘤的患者的说明书。也可通过比较扩增的核酸的电泳迁移率和相应编码野生型FGFR3的核酸的电泳迁移率,由此来检测突变。迁移率差异表明扩增的核酸序列中存在突变。可通过任何合适的分子分离技术,例如在聚丙烯酰胺凝胶上,来确定电泳迁移率。利用酶突变检测(EMD),也可分析核酸来检测突变(Delxa0Tito等,Clinicalxa0Chemistry(临床化学)44:731-739,1998)。EMD使用噬菌体解离酶T₄内切核酸酶VII,其扫描双链DNA直到它检测并切割了由碱基对错配造成的结构变形,所述错配由核酸改变诸如点突变、插入和缺失造成。例如通过凝胶电泳,检测到两个由解离酶切割形成的短片段,表明存在突变。EMD方法的益处是以单个方案直接从扩增反应中鉴定出所检验的点突变、缺失、和插入,不需要纯化样品,缩短了杂交时间,并提高了信噪比。包含比正常至多过量20倍的大小至多4kb的核酸和片段的混合样品可进行测试。可是,EMD扫描不能鉴定在突变阳性样品中发生的特定碱基改变,所以如果需要,通常要额外的测序步骤来鉴定特定的突变。如美国专利No.5,869,245所证实的,相似地可用CELxa0I酶替代解离酶T₄内切核酸酶VII。另一种用于检测突变的简单试剂盒是反向杂交测试条,其与用于检测HFE、TFR2和FPN1基因中造成血色病(Haemochromatosis)的多重突变的Haemochromatosisxa0StripAssay^TM(Viennalabshttp://www.bamburghmarrsh.com/pdf/4220.pdf)相似。这种测试基于PCR扩增后的序列特异性杂交。对于单突变测试,可使用基于微量板的检测系统,而对于多重突变测试,可使用测试条作为“宏阵列(macro-arrays)”。试剂盒可包括可供样品制备、扩增和突变检测即时使用的试剂。多重扩增方案提供了便利,并允许以非常有限的体积来测试样品。利用直接StripAssay形式,可以在小于5小时内完成二十个以上突变的测试,而无需昂贵设备。从样品中分离DNA并体外扩增靶核酸(例如通过PCR),并用生物素标记,一般可在单个(“多重”)扩增反应中进行。然后,扩增产物选择性地与固定在诸如测试条的固体支持物上的寡核苷酸探针(野生型和突变体特异的)杂交,其中探针固定为平行线或条带。利用链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶和有色底物,来检测结合的生物素化的扩增子。这样的测试能检测本发明的所有突变或其任意子集。对于特定的突变体探针条带,三种信号传导模式之一是有可能的:(i)仅针对野生型探针的条带,其表明是正常的核酸序列,(ii)针对野生型和突变体探针的条带,其表明是杂合基因型,和(iii)仅针对突变体探针的条带,其表明是纯合突变体基因型。因此,在一个方面,本发明提供了检测本发明突变的方法,其包括从样品中分离和/或扩增靶FGFR3核酸序列,使得扩增产物包含配体,使扩增产物与包含针对该配体的可检测结合配偶体的探针接触,而且该探针能够与本发明的突变特异性杂交,然后检测所述探针与所述扩增产物的杂交。在一个实施方案中,配体是生物素,而结合配偶体包括抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。在一个实施方案中,结合配偶体包括链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶,其可用有色底物检测。在一个实施方案中,例如,探针固定于测试条上,其中与不同突变互补的探针彼此分开。可选地,扩增的核酸用放射性同位素标记,在该情况中,探针不必包含可检测的标记物。野生型基因的改变涵盖所有形式的突变,诸如插入、倒位、缺失、和/或点突变。在一个实施方案中,突变是体细胞的。体细胞突变是仅发生于某些组织中(例如在肿瘤组织中)且不在种系中遗传的那些。种系突变可以在任何身体组织中找到。包含靶核酸的样品可通过本领域公知的方法获得,而且它们适于特定类型和位置的肿瘤。组织活检通常用于获得有代表性的肿瘤组织片。可选地,可以已知或认为包含目的肿瘤细胞的组织/流体的形式间接获取肿瘤细胞。例如,肺癌损伤的样品可通过切除术、支气管镜检、细针抽吸、支气管刷检、或从痰、胸膜液或血液中获得。可从肿瘤或从其它身体样品诸如尿、痰或血清中检测出突变的基因或基因产物。上述讨论的用于检测肿瘤样品中突变的靶基因或基因产物的同样技术可用于其它身体样品。癌细胞从肿瘤上脱落下来,并出现在这些身体样品中。通过筛选这些身体样品,可实现对于诸如癌症的疾病的简单早期诊断。另外,通过对这些身体样品测试突变的靶基因或基因产物,可更容易地监测治疗的进展。用于富集肿瘤细胞的组织制备物的手段是本领域已知的。例如,可以从石蜡或低温恒温保存的切片中分离组织。癌细胞也可通过流式细胞术或激光捕捉显微解剖而与正常细胞分开。这些以及其它分离肿瘤和正常细胞的技术是本领域公知的。如果肿瘤组织被正常细胞高度污染,那么检测突变可能更困难,尽管最小化污染和/或假阳性/阴性结果的技术是已知的,其中一些在下文有描述。例如,也可以对样品评估生物标志物(包括突变)的存在情况,所述标志物已知与目的肿瘤细胞有关而与相应的正常细胞无关,反之亦然。可通过用本领域公知的技术来分子克隆靶核酸并测序该核酸,由此来完成靶核酸中点突变的检测。可选地,诸如聚合酶链式反应(PCR)的扩增技术可用于直接从肿瘤组织的基因组DNA制备物中扩增出靶核酸序列。然后确定扩增序列的核酸序列并鉴定其突变。扩增技术是本领域公知的,例如描述于Saiki等,Science(科学)239:487,1988;美国专利Nos.4,683,203和4,683,195中的聚合酶链式反应。应当注意,设计并选择合适的引物是本领域中充分确定的技术。本领域已知的连接酶链式反应也可用于扩增靶核酸序列。参见例如Wu等,Genomics(基因组学),Vol.4,pp.560-569(1989)。另外,也可使用称为等位基因特异性PCR的技术。参见例如Ruano和Kidd,Nucleicxa0AcidsResearch(核酸研究),Vol.17,p.8392,1989。根据该技术,使用的引物在其3′端与特定靶核酸突变杂交。如果不存在特定的突变,那么不会观察到扩增产物。也可以使用耐扩增突变系统(Amplificationxa0Refractoryxa0MutationSystem,ARMS),其如欧洲专利申请公开号0332435和Newton等,NucleicAcidsxa0Research(核酸研究),Vol.17,p.7,1989所公开的。基因的插入和缺失也可通过克隆、测序和扩增来检测。另外,基因或周围标志基因的限制性片段长度多态性(RFLP)探针可用于对等位基因的改变或多态性片段中的插入来评分。也可用单链构象多态性(SSCP)分析来检测等位基因的碱基变化变体。参见例如Orita等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)Vol.86,pp.2766-2770,1989,和Genomics(基因组学),Vol.5,pp.874-879,1989。也可用其它用于检测插入和缺失的本领域已知技术。根据基因野生型表达产物的改变,也可检测野生型基因的改变。这些表达产物包括mRNA以及蛋白质产物。通过扩增和测序mRNA或分子克隆由mRNA制备的cDNA,来检测点突变。利用本领域公知的DNA测序技术,可以确定克隆的cDNA的序列。cDNA也可以通过聚合酶链式反应(PCR)来测序。错配是没有100%互补性的杂交核酸双链。缺乏完全的互补性可以是因为缺失、插入、倒位、置换或移码突变造成的。可用错配检测来检测靶核酸中的点突变。尽管这些技术可能不如测序灵敏,然而对大量组织样品来说更容易实施。错配裂解技术的实例是RNA酶保护方法,其在Winter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报),Vol.82,p.7575,1985,和Meyers等,Science(科学),Vol.230,p.1242,1985中有详细描述。例如,本发明的方法可包括使用标记的核糖核酸探针(riboprobe),其与人野生型靶核酸互补。衍生自组织样品的核糖核酸探针和靶核酸在一起退火(杂交),然后用RNA酶A消化,其能够检测双链RNA结构中的一些错配。如果RNA酶A检测到错配,那么它在错配位点裂解。因此,当在电泳凝胶基质上分离退火的RNA制备物时,如果RNA酶A检测到错配并裂解,那么将见到比核糖核酸探针与mRNA或DNA的全长双链RNA小的RNA产物。考虑到它涵盖了怀疑突变了的位置,核糖核酸探针不需要是靶核酸mRNA或基因的全长,但可以是靶核酸的一部分。如果核糖核酸探针仅包含靶核酸mRNA或基因的一个区段,如果需要,那么可能希望使用大量这些探针来筛选整个靶核酸序列的错配。以相似的方式,可用DNA探针检测错配,例如通过酶或化学裂解进行。参见例如Cotton等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报),Vol.85,4397,1988;和Shenk等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报),Vol.72,p.989,1975。可选地,通过错配双链体相对于匹配双链体的电泳迁移率变化,可检测错配。参见例如Cariello,Humanxa0Genetics(人类遗传学),Vol.42,p.726,1988。用核糖核酸探针或DNA探针,可以在杂交前扩增可能包含突变的靶核酸mRNA或DNA。尤其是如果改变是总的重排,诸如缺失和插入,那么利用Southern杂交也可检测靶核酸DNA中的改变。扩增出的靶核酸DNA序列也可用等位基因特异性探针筛选。这些探针是核酸寡聚物,每一个都包含靶核酸基因中包含已知突变的区域。例如,一个寡聚物的长度可以为约30个核苷酸,对应于部分靶基因序列。通过使用一组这样的等位基因特异性探针,可筛选靶核酸扩增产物,以鉴定靶基因中以前鉴定出的突变的存在。可以例如在尼龙滤器上进行等位基因特异性探针与扩增的靶核酸序列的杂交。在严格杂交条件下与特定探针的杂交表明肿瘤组织中存在与等位基因特异性探针中相同的突变。通过筛选相应野生型蛋白的改变,可检测野生型靶基因的改变。例如,与靶基因产物有免疫反应性的单克隆抗体可用于筛选组织,例如用已知与基因产物(蛋白质)的特定突变位置结合的抗体。例如,所用的抗体可以是结合缺失的外显子的抗体或结合包含靶蛋白缺失部分的构象表位的抗体。缺少关联抗原将表示有突变。突变等位基因产物的特异性抗体也可用于检测突变基因产物。可以从噬菌体展示文库中鉴定抗体。这些免疫学测定法可以以本领域已知的任何便利形式进行。这些包括Western印迹、免疫组织化学测定法和ELISA测定法。任何检测改变的蛋白质的方法都可用于检测野生型靶基因的改变。利用核酸扩增技术,诸如聚合酶链式反应,引物对可用于确定靶核酸的核苷酸序列。单链DNA引物对可以与靶核酸序列之内或周围的序列退火,从而引发靶序列的扩增。也可使用等位基因特异性引物。该引物仅与特定的突变靶序列退火,因此仅在存在突变的靶序列作为模板的情况下才会扩增出产物。为了便于接下来克隆扩增的序列,引物可具有限制酶位点序列,该序列附加在这些引物的末端。这些酶和位点是本领域公知的。可以用本领域公知的技术来合成引物本身。一般而言,可用寡核苷酸合成仪制造引物,所述仪器可从商业渠道获得。设计特定引物完全在本领域技术范围内。核酸探针可用于许多目的。它们可用于对基因组DNA的Southern杂交中,并可用于RNA酶保护方法中以检测上文已经讨论过的点突变。探针可用于检测靶核酸扩增产物。利用其它技术,它们也可用于检测野生型基因或mRNA的错配。利用酶(例如S1核酸酶)、化学药品(例如羟胺或四氧化锇和哌啶)、或错配杂交体相对于完全匹配杂交体的电泳迁移率变化,可检测错配。这些技术是本领域已知的。参见Novack等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报),Vol.83,p.586,1986。一般而言,探针与激酶结构域外的序列互补。整组核酸探针可用于组成试剂盒来检测靶核酸中的突变。试剂盒容许进行对目的靶序列的大区域的杂交。探针可彼此交叠或毗邻。如果用核糖核酸探针来检测与mRNA的错配,那么它一般与靶基因的mRNA互补。因此,核糖核酸探针是反义探针,因为由于它与有义链互补,它不编码相应的基因产物。核糖核酸探针一般会用放射性、比色、或荧光材料来标记,这可以通过任何本领域已知方法来实现。如果用核糖核酸探针来检测与DNA的错配,它可以是任一极性,即有义的或反义的。相似地,也可用DNA探针来检测错配。在一些情况下,癌症过表达或不过表达FGFR3。可在诊断或预后测定中通过评估细胞表面上存在的受体蛋白质水平的升高(例如通过免疫组化测定,IHC)来测定受体的过表达。备选地,或者另外地,可测量细胞中编码受体的核酸的水平,例如通过荧光原位杂交(FISH;参见1998年10月公布的WO98/45479)、southern印迹或聚合酶链式反应(PCR)技术,诸如实时定量PCR(RT-PCR)。在上述测定法之外,熟练从业人员还可利用多种体内测定法。例如,可将患者体内细胞暴露于任选用可检测标记物例如放射性同位素标记的抗体,并且可评估该抗体与患者内细胞的结合,例如通过外部扫描放射性或通过分析取自事先已暴露于所述抗体的患者的活组织检查。化疗剂本发明的联合疗法可以进一步包含一种或多种化疗剂。联合给药包括使用单独的制剂或单一的药物制剂的共同施用或同时施用,和以任意的顺序连续施用,其中优选在两种(或所有)活性剂同时发挥它们的生物活性时存在一定的时间段。如果施用的话,化疗剂通常以其已知的剂量施用,或任选地由于药物的联合作用或归因于抗代谢物化疗剂的施用所引起的不良副作用而以降低的剂量施用。对于此类化疗剂的制备和给药方案可以根据生产商的说明书或由专业从业人员通过经验确定来使用。在本文中公开了可以联合的多种化疗剂。在一些实施方案中,待联合的化疗剂选自由下列各项组成的组:来那度胺(REVLIMID),蛋白体抑制剂(诸如硼替佐米(VELCADE)和PS342),紫杉烷(boraxa0taxoid)(包括多西他赛(docetaxel)和紫杉醇(paclitaxel)),长春花属(诸如长春瑞滨(vinorelbine)或长春碱(vinblastine)),铂化合物(诸如卡铂(carboplatin)或顺铂(cisplatin)),芳香酶抑制剂(诸如来曲唑(letrozole),阿那曲唑(anastrazole),或依西美坦(exemestane)),抗雌激素(例如,氟维司群(fulvestrant)或他莫昔芬(tamoxifen)),依托泊苷(etoposide),塞替哌(thiotepa),环磷酰胺(cyclophosphamide),培美曲塞(pemetrexed),甲氨蝶呤(methotrexate),多柔比星脂质体(liposomalxa0doxorubicin),聚乙二醇化多柔比星脂质体,卡培他滨(capecitabine),吉西他滨(gemcitabine),melthalin,多柔比星(doxorubicin),长春新碱(vincristine),COX-2抑制剂(例如,塞来考昔(celecoxib)),或类固醇(例如,地塞米松(dexamethasone)和泼尼松(prednisone))。在一些实施方案中(例如涉及治疗t(4;14)+多发性骨髓瘤的实施方案),联合地塞米松和来那度胺,或地塞米松,或硼替佐米,或长春新碱,多柔比星和地塞米松,或来那度胺和地塞米松,或多柔比星脂质体,长春新碱和地塞米松,或来那度胺和地塞米松,或硼替佐米和地塞米松,或硼替佐米,多柔比星,和地塞米松。在一些实施方案中(例如,涉及膀胱癌的实施方案),吉西他滨和顺铂,或紫杉烷(例如,紫杉醇,多西他赛),或培美曲塞,或甲氨蝶呤,长春碱,多柔比星和顺铂,或卡铂,或丝裂霉素C结合5-氟尿嘧啶,或顺铂,或顺铂和5-氟尿嘧啶相联合。制剂、剂量和施用可以与优良医学实践一致的方式配制、剂量给药和施用本发明中使用的治疗剂。在这种情形中考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体受试者、患者个体的临床状态、病症的起因、投递药剂的部位、施药的方法、施药的日程安排、将要组合的药剂的药物-药物相互作用和医学从业人员已知的其它因素。治疗用制剂可通过将具有期望纯度的活性成分与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合使用本领域已知的标准方法而制备(Remington′sxa0Pharmaceuticalxa0Sciences(雷明顿制药科学)(第20版),编辑A.Gennaro,2000,Lippincott,Williamsxa0&xa0Wilkins,Philadelphia,PA)。可接受的载体包括盐水或缓冲剂,诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸;抗氧化剂,包括抗坏血酸;低分子量(少于约10个残基)多肽;蛋白质,诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸;单糖、二糖和其它糖类,包括葡萄糖、甘露糖或糊精;螯合剂,诸如EDTA;糖醇,诸如甘露醇、或山梨醇;成盐平衡离子,诸如钠;和/或非离子表面活性剂,诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或PEG。任选地,但优选地,制剂含有药用盐,优选为氯化钠,且优选大约为生理浓度。任选地,本发明的制剂可包含药用防腐剂。在一些实施方案中,防腐剂浓度范围在0.1至2.0%,典型地为v/v。适当的防腐剂包括制药领域已知的那些。优选的防腐剂是苯甲醇、酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。任选地,本发明的制剂可包含浓度为0.005至0.02%的药用表面活性剂。本文中的制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物,优选活性互补且彼此没有不利影响的那些。合适的是,此类分子以对于预定目的有效的量组合。活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、包载在胶状药物投递系统中(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或包载在粗滴乳状液(macroemulsion)中。此类技术披露于Remington′sxa0Pharmaceuticalxa0Sciences,见上文。可制备缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质,该基质是定型产品的形式,例如薄膜或微胶囊。缓释基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONxa0DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙立德构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能够释放分子达100天以上,但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当封装的抗体在体内长时间维持时,它们可能由于暴露于37°C的潮湿环境而变性或聚集,导致生物学活性损失和可能的免疫原性改变。可以根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如,如果发现聚集机制是经由硫代-二硫化物互换的分子间S-S键形成,那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适当添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定。本发明的治疗剂依照已知的方法施用给人患者,诸如,作为推注或通过一段时间的连续输注的静脉内施用,通过肌肉内的、腹膜内的、脑脊内的、皮下的、关节内的、滑膜内的、鞘内的、口腔的、局部的、或吸入途径。离体(exxa0vivo)策略也可在治疗性应用中使用。离体策略涉及通过编码FGFR3拮抗剂的多核苷酸转染或转导从受试者获得的细胞。该转染或转导的细胞然后回输至受试者。该细胞可以是许多类型的任一种,包括但不限于造血细胞(例如骨髓细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、T细胞或B细胞)、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、角质细胞或肌细胞。例如,如果FGFR3拮抗剂是抗体,该抗体通过任何合适的手段施用,所述手段包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内途径,并且如果希望局部免疫抑制治疗,进行损伤内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或者皮下施用。此外,通过脉冲输注,尤其使用降低剂量的抗体合适地施用抗体。优选地,给药通过注射给予,最优选地通过静脉内或皮下注射给予,这部分取决于施用是短期还是长期的。在另一个实例中,当病症或肿瘤的位置允许时,FGFR3拮抗剂化合物局部施用,例如通过直接注射,并且该注射可周期性地重复。FGFR3拮抗剂也可系统投递给受试者或直接投递至肿瘤细胞,例如投递至肿瘤或手术切除肿瘤后的瘤床,以预防或降低局部复发或转移。组合施用治疗剂典型地在限定的时间期间(根据所选的组合通常数分钟、数小时、数天或数周)进行。联合疗法意图涵盖以连续的方式施用这些治疗剂,即其中每种治疗剂在不同时间施用,以及涵盖以基本同时的方式施用这些治疗剂,或至少该治疗剂中的两种。治疗剂可通过相同的途径或不同的途径施用。例如组合中的抗FGFR3抗体可通过静脉内注射施用,而组合中的化疗剂可口服施用。备选地,例如,两种治疗剂均可口服施用,或两种治疗剂均可通过静脉内注射施用,这取决于具体治疗剂。治疗剂施用的顺序也根据具体药剂而变化。取决于疾病的类型和严重性,约1μg/kg至100mg/kg的每种治疗剂是施用于患者的初始候选剂量,例如,无论通过一次或多次单独的给药,或通过连续输注。典型的日剂量可以在约1μg/kg至约100mg/kg以上的范围内,这取决于上面提及的因素。对于在几天或更长时间内的反复给药,取决于病况,持续治疗直至癌症被治疗,如上述方法所测量的那样。然而,可以使用其他给药方案。本申请设想通过基因疗法来施用FGFR3抗体。关于使用基因疗法来产生胞内抗体,参见例如1996年3月14日公开的WOxa096/07321。制品在本发明的另一个方面中,提供了包含可用于治疗、预防和/或诊断上文所述病症的物质的制品。所述制品包括容器和在容器上或与其相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶(bottle)、药瓶(vial)、注射器等。所述容器可以用多种材料制成,诸如玻璃或塑料。所述容器装有组合物,其本身存在或当与有效治疗、预防和/或诊断所述病况的另一种或多种组合物组合时,可以具有无菌存取口(例如所述容器可以是带有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或药瓶)。在所述组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指明该组合物用于治疗所选择的病况,诸如癌症。而且,所述制品可以包含(a)具有包含在其中的组合物的第一容器,其中所述组合物包含本发明的抗体;和(b)具有包含在其中的组合物的第二容器,其中所述组合物包含另外的细胞毒性药剂。在本发明的该实施方案中的制品还可以包含包装插页,其说明可以将第一和第二抗体组合物用于治疗特定病况,例如癌症。备选地,或另外地,所述制品还可以包含第二(或第三)容器,其包含药用缓冲液,如用于注射的抑菌水(BWFI)、磷酸缓冲盐溶液、林格氏溶液和葡萄糖(dextrose)溶液。其可进一步包括从商业和用户立场出发所需要的其它物质,包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。下述是本发明的方法和组合物的实例。应当理解考虑上文提供的一般描述可以实施多种其它实施方案。实施例材料和方法细胞和细胞培养细胞系RT4获自美国典型培养物保藏中心(Americanxa0Typexa0Cellxa0CultureCollection)。细胞系RT112,OPM2和Ba/F3购自德国微生物和细胞培养物培养物保藏中心(Germanxa0Collectionxa0ofxa0Microorganismsxa0andxa0Cellxa0Cultures)(DSMZ,(Germany))。多发性骨髓瘤细胞系KMSxa011由川崎医学院(KawasakiMedicalxa0School)(日本)的Takemixa0Otsuki博士馈赠。膀胱癌细胞系TCC-97-7由圣詹姆斯大学医院(Stxa0James’sxa0Universityxa0Hospital(Leeds,UK))的Margaretxa0Knowles博士馈赠。UMUC-14细胞系获自H.B.Grossman博士(目前在得克萨斯大学安德森癌症中心(Universityxa0ofxa0Texasxa0M.D.AndersonCancerxa0Center),TX)。细胞用补充了10%胎牛血清(FBS)(Sigma),100U/ml青霉素,0.1mg/ml链霉素和L-谷氨酰胺的RPMI培养基在5%CO₂的条件下在37°C维持生长。FGFR3^S249C二聚作用研究UMUC-14细胞生长在无半胱氨酸培养基中,用R3Mab或DTNB处理3hr,并将细胞裂解物在还原或非还原条件下进行免疫印迹分析。对于体外二聚作用研究,将FGFR3-IIIb^S249C(残基143-374)克隆至pAcGP67A载体中,并在T.nixa0Pro细胞中表达。通过Ni-NTA柱,然后通过Superdexxa0S200柱纯化重组蛋白。二聚体FGFR3^S249C在25mMxa0Tris(pHxa07.5)和300mMNaCl中洗脱。R3Mab(1μM)与FGFR3^S249C二聚体(0.1μM)在37°C下在下列的条件下温育:100mMxa0KH₂PO4(pHxa07.5),25μMxa0DTT,1mMxa0EDTA和0.75mg/mlxa0BSA。在指定的时间点获取反应物的等分试样,并且通过添加不含β-巯基乙醇的样品缓冲液终止反应。通过免疫印迹分析二聚体-单体。异种移植物研究所有研究得到Genentech机构动物管理和使用委员会(Genentech’sInstitutionalxa0Animalxa0Carexa0andxa0Usexa0Committee)的批准。6-8周龄雌性nu/nu小鼠或CB17严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠购自Charlesxa0River实验室(Hollister,CA)。雌性无胸腺裸鼠获自国立癌症学会-弗雷德里克癌症中心(Nationalxa0Cancerxa0Institute-Frederickxa0Cancerxa0Center)。小鼠在无特殊病原体条件下饲养。RT112xa0shRNA稳定的细胞(7x10⁶),RT112(7x10⁶),Ba/F3-FGFR3^S249C(5x10⁶),OPM2(15x10⁶),或KMS11细胞(20x10⁶)以在HBSS/基质胶(matrigel)(1∶1v/v,BDxa0Biosciences)中的0.2ml体积皮下植入至小鼠的侧腹中。植入不含基质胶的UMUC-14细胞(5x10⁶)。使用测径器测量肿瘤每周两次,并且使用下面的公式计算肿瘤体积:V=0.5axb²,其中a和b分别是肿瘤的长度和宽度。当平均肿瘤体积达到150-200mm³时,将小鼠随机化分到每组10只的各组中,并且腹膜内(i.p)注射HBSS中稀释的R3Mab(0.3-50mg/kg)或对照人IgG1,每周处理两次。对照动物只给予赋形剂(HBSS)。统计学汇总的数据表示为均值+/-SEM。对于两组间的比较使用非配对斯氏t检验(双尾)。在所有试验中P<0.05的值被认为是统计学显著的。FGFR3shRNA稳定细胞的生成将三种独立的FGFR3shRNA如(1)所述克隆进pHUSH载体中。在本研究中使用的FGFR3xa0shRNA的序列如下:shRNA2:5’GATCCCCGCATCAAGCTGCGGCATCATTCAAGAGATGATGCCGCAGCTTGATGCTTTTTTGGAAA(SEQxa0IDxa0NO:192);shRNA4:5’-GATCCCCTGCACAACCTCGACTACTATTCAAGAGATAGTAGTCGAGGTTGTGCATTTTTTGGAAA-3’(SEQxa0IDxa0NO:193);shRNA6:5’-GATCCCCAACCTCGACTACTACAAGATTCAAGAGATCTTGTAGTAGTCGAGGTTTTTTTTGGAAA-3’(SEQxa0IDxa0NO:194)。所有构建体均通过测序确认。EGFP对照shRNA描述在我们先前的研究中(50)。包含shRNA的逆转录病毒通过用VSV-G(Clontechxa0Laboratories)和pHUSH-FGFR3shRNA构建体共转染GP2-293包装细胞(Clontechxa0Laboratories,MountainView,CA)来产生,并且在转染后72hr收获病毒上清液,并通过离心清除细胞碎片用于转导实验。RT112细胞在包含无四环素FBS(Clontechxa0Laboratories)的RPMIxa01640培养基中维持生长,并用逆转录病毒上清液在存在4μg/ml聚凝胺的条件下转导。感染72小时后,向培养基中加入2μg/ml嘌呤霉素(ClontechLaboratories)以选择表达shRNA的稳定克隆。分离稳定的细胞,用0.1或1μg/ml强力霉素(Clontechxa0Laboratories)处理4天,通过Western印迹分析评估FGFR3蛋白表达的可诱导性敲低。如(51)所述进行细胞周期分析。选择对FGFR3特异的噬菌体抗体在选择的互补决定区(H1,H2,H3,L3)中具有合成多样性的模拟人IgG所有组成成分(repertoire)的天然多样性的人噬菌体抗体文库用于淘选。Fab片段双价地展示在M13噬菌体颗粒的表面上(52)。将人FGFR3-IIIb和IIIc的His-标记的IgD2-D3用作抗原。96孔MaxiSorp免疫测定板(Nunc)用FGFR3-IIIb-His蛋白或FGFR3-IIIC-His蛋白(10μg/ml)在4°C下包被过夜并用补充了1%BSA的PBST缓冲液(含0.05%吐温20的PBS)封闭1小时。加入抗体噬菌体文库并在室温(RT)下温育过夜。用PBST缓冲液洗涤测定板,用50mMxa0HCl和500mMxa0NaCl洗脱结合的噬菌体30分钟,并用等体积的1Mxa0Tris碱中和。回收的噬菌体在大肠杆菌XL-1blue细胞中扩增。在随后的选择轮次中,噬菌体抗体的温育时间减少至2小时,测定板洗涤的严格性逐渐增加(53)。通过噬菌体ELISA和DNA测序鉴定与FGFR3的IIIb和IIIc同种型两者均结合的独特的和特异的噬菌体抗体。在筛选的400个克隆中,选择出4个通过分别将各个克隆的VL和VH区克隆至LPG3和LPG4载体中来重新格式化成全长IgG,在哺乳动物细胞中瞬时表达,并用蛋白A柱纯化(54)。选择克隆184.6用于亲和力成熟。对于亲和力成熟,在M13噬菌体的表面上展示单价Fab的噬菌粒(52)充当移植噬菌体Ab的轻链(VL)和重链(VH)可变结构域的文库模板。将终止密码子结合在CDR-L3中。如(53)所述对于亲和力成熟采用简单(soft)随机化策略。选择CDR环的两个不同组合,H1/H2/L3,H3/L3,或L1/L2/L3进行随机化。为了选择亲和力成熟的克隆,针对FGFR3IIIb或IIIc-His蛋白分选噬菌体文库,如(52)所述进行第一轮测定板分选,然后进行四轮溶液相分选。5轮淘选后,如(55)所述使用高通量单点竞争性噬菌体ELISA来快速筛选高亲和力克隆。选择在存在10nMxa0FGFR3-His的条件下与缺少FGFR3-His的条件下450nm处吸光度的比率低的克隆用于进一步表征。克隆184.6.1,184.6.21,184.6.49,184.6.51,184.6.58,184.6.62和184.6.92显著降低了Ba/F3-FGFR3-IIIb,Ba/F3-FGFR3-IIIc和Ba/F3-FGFR3-S249C细胞系的活力,且克隆184.6.52显著降低了Ba/F3-FGFR3-S249C细胞系的活力。根据测定的细胞系不同,增加的抑制活性范围为亲代克隆184.6的约50倍(克隆184.6.52)至约100倍(克隆184.6.1,184.6.21,184.6.49,184.6.51,184.6.58,184.6.62和184.6.92)。使用BIAcore如下测定克隆184.6.1,184.6.58,和184.6.62与FGFR3-IIIb和FGFR3-IIIc的结合动力学:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>克隆184.6.1,184.6.58,和184.6.62也显示对Ba/F3-FGFR3细胞、RT112细胞和OPM2细胞中FGFR3下游信号传导的抑制提高。选择克隆184.6.1。将一个序列修饰N54S在残基54处引入至HVRxa0H2以提高可制造性,形成克隆184.6.1N54S。克隆184.6.1和184.6.1N54S显示相当的结合动力学(在Biacore测定中测量)和在Ba/F3细胞活力测定中相当的活性。生成另外的HVRxa0H2变体:将N54S引入至克隆184.6.58中,并将N54G,N54A,或N54Q引入至克隆184.6.1和184.6.58中。这些克隆在Ba/F3细胞活力测定中显示与亲代克隆184.6.1或184.6.58相当的活性。将另一个序列修饰D30E引入至克隆184.6.1N54S的HVRxa0L1中,形成克隆184.6.1NSD30E。克隆184.6.1NSD30E和克隆184.6.1N54S显示与亲代克隆184.6.1或184.6.58相当的结合动力学和在BA/F3细胞活力测定中显示相当的活性。当用于本文时,“R3Mab”是指抗-FGFR3抗体克隆184.6.1N54S,184.6.1,或184.6。克隆184.6.1N54S用在提及“R3Mab”的附图和试验中,例外是得到下列附图中显示的结果的试验(其使用的抗体显示在括号中):图9B(克隆184.6.1),10(克隆184.6),11A和B(克隆184.6),13(克隆184.6.1),14A(克隆184.6.1),14B,G,和H(克隆184.6),19(克隆184.6.1),和22B和C(克隆184.6.1)。测定抗体结合亲和力的BIAcore/表面等离振子共振(SRP)分析R3Mab与FGFR3的结合亲和力通过Biacore/SRP使用BIAcore^TM-3000仪器如(52)所述采用下列的改良测量。将R3Mab直接包被在CM5生物传感器芯片上以达到大约400响应单位(RU)。对于动力学测量,FGFR3-IIIb或IIIc-His蛋白的两倍连续稀释液(从67nM起始)在25°C以30μl/min的流速注入PBST缓冲液中。使用简单一对一朗格缪尔结合模型(BIAcore评价软件3.2版(BIAcorexa0evaluationxa0Softwarexa0versionxa03.2))计算结合速率(Kon,perxa0mol/s)和解离速率(Koff,perxa0s)。平衡解离常数(Kd,permol)以Koff/Kon的比率计算。如下通过Biacore/SRP测量针对FGFR3的小鼠杂交瘤抗体的结合亲和力。将人FGFR3-IIIb或IIIc偶联至BIACORETMxa0CM5传感器芯片的三个不同的流动池(flowxa0cell,FC),FC2,FC3和FC4以达到约50RU的响应单位(RU)。使用生产商提供的试验方案通过氨基的随机偶联实现固定化。通过以30μl/min的流速注射250nM-0.48nM的范围内以2倍增量增加的系列溶液,记录在25°C下杂交瘤来源的抗FGFR3鼠IgG或Fab片段与这些表面结合的传感图。在每次注射之间,10mM甘氨酸-HClxa0pHxa01.7充当缓冲液以再生传感器芯片。从在FC2,FC3和FC4处观察到的传感图中减去来自参照池(FC1)的信号。通过数据的非线性回归拟合根据1∶1朗格缪尔结合模型使用BIAcore评价软件(3.2版)(由制造商提供)计算动力学常数。ELISA结合研究将编码人FGFR1-IIIb,IIIc,FGFR2-IIIb和IIIc,FGFR3-IIIb和IIIc,和FGFR4的细胞外结构域(ECD)的cDNA克隆至基于pRK的载体中生成人FGFR-人Fc嵌合蛋白。通过瞬时转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生重组蛋白,并经由蛋白A亲和层析纯化。为了测试抗体与人FGFR的结合,将Maxisorpxa096孔板(Nunc)用50μlxa02μg/ml的FGFRxa0ECD-人Fc嵌合蛋白在4°C下包被过夜。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)/3%BSA封闭后,加入FGFR3抗体并在RT下温育2小时。使用HRP-缀合的抗-人Fab和TMB过氧化物酶产色底物(colorigenicxa0substrate)(KPL,Gaithersburg,MD)检测特异性结合的FGFR3抗体。为了测试针对FGFR3的抗体对FGF/FGFR3相互作用的效用,将FGFR3-Fc嵌合蛋白俘获在包被以抗-人免疫球蛋白Fcγ片段特异性抗体(Jacksonxa0Immunoresearch,Westxa0Grove,PA)的Maxisorp测定板上。洗涤后,将渐增量的FGFR3抗体加入至测定板并温育30分钟。然后,加入FGF1或FGF9和肝素,在RT下温育2小时。洗涤测定板,并与生物素化的FGF1-特异性多克隆抗体(BAF232)或生物素化FGF9抗体(BAF273,R&DSystems)温育1小时,然后用链霉抗生物素蛋白-HR和TMB检测。Ba/F3-FGFR3稳定细胞的生成将编码全长人FGFR3IIIb或IIIc的cDNA克隆至pQCXIP载体(Clontechxa0Laboratories,Mountainxa0View,CA)中以生成pQCXIP-FGFR3-IIIb或IIIc。特异性突变,即,将R248C,S249C,G372C,Y375C和K652E经QuickChange(Stratagene,Laxa0Jolla,CA)引入至cDNA中。为了生成表达野生型或突变FGFR3的Ba/F3稳定的细胞,将多种pQCXIP-FGFR3构建体与VSV-G质粒(Clontechxa0Laboratories)共转染至包装细胞GP2-293中。在用2μg/ml嘌呤霉素选择2周后,将表达野生型或突变FGFR3的细胞用藻红蛋白缀合的抗-人FGFR3mAb(FAB766P,R&Dxa0Systems)染色,并通过荧光激活细胞分选(FACS)选择用于功能测定。对于在96孔微量滴定板中的细胞增殖测定,使用下列的细胞密度:对于表达野生型FGFR3-IIIb和FGFR3-K652E的细胞:5,000细胞/孔;对于其余的细胞:10,000细胞/孔。细胞接种在补充了10%胎牛血清,10ng/mlxa0FGF1和10μg/ml肝素(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的RPMIxa01640培养基中。R3Mab以指定的浓度加入,并且小鼠杂交瘤FGFR3抗体在FGFR3-IIIb实验中以2000-0.49ng/ml(以4倍连续稀释液)加入,在FGFR3-IIIc实验中以5000-1.2ng/ml(以4倍连续稀释液)加入。温育72小时后,用CellTiter-Glo(Promega,Madison,WI)评价细胞活力。细胞增殖测定对于RT112,RT4和TCC-97-7细胞的增殖测定,将3000细胞/孔接种至96孔微量滴定板中并使其贴壁过夜。然后用含有指定浓度的对照或R3Mab的低血清培养基(0.5%FBS)更换培养基。温育4天后,向每孔中加入1μCi[甲基-³H]胸苷(PerkinElmer,Waltham,MA),并另外温育16小时。使用Packardxa0Filtermatexa0Harvester将细胞转移至UniFilters,并使用TopCount(PerkinElmer)测量掺入至生长细胞的基因组DNA中的[³H]-胸苷。在一些情况下,在与抗体温育4天后用CellTiter-Glo(Promega)评价细胞活力。值表示为四次实验的均值+/-SE。克隆生长测定根据前述的试验方案(50)评价R3Mab对细胞克隆形成能力的作用。简言之,400个UMUC-14细胞接种至6孔板中补充了10%胎牛血清的DMEM培养基中,使其贴壁过夜。然后加入在0.1%BSA培养基中稀释的R3Mab或对照抗体至10μg/ml的终浓度。仅使用等体积的0.1%BSA培养基(模拟(Mock))用作另一对照。细胞孵育约12天直至对照组中的细胞形成足够大的集落。集落用0.5%结晶紫染色,使用GelCount(Oxford,UK)定量集落的数目和大小。直径大于120μm的集落的数目表示为均值+/-SEM(n=12)。免疫沉淀和免疫印迹分析为了研究抗体对FGFR3信号传导的作用,将细胞在无血清培养基中饥饿过夜,然后开始处理。细胞与在0.1%BSA(w/v),RPMIxa01640培养基中稀释的任一种抗体,或与仅0.1%BSA培养基(模拟)温育。在37°C下3小时后,将FGF1(终浓度为15ng/ml)和肝素(终浓度为5-10μg/ml)加入至一半样品中。作为对照,仅将相似体积的肝素加入至另一半样品中。继续温育10min。通过抽吸移除上清液,并用冰冷的PBS洗涤细胞,然后在补充了1mM原钒酸钠和完全蛋白酶抑制剂混合物(Rochexa0Appliedxa0Science,Indianapolis,IN)的RIPA缓冲液(Upstate,Charlottesville,VA)中裂解。通过离心清除裂解物中的不溶物质。使用兔多克隆抗体(sc-123,Santaxa0Cruzxa0Biotechnology,Santaxa0Cruz,CA)免疫沉淀FGFR3并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western印迹进行分析。用针对磷酸-酪氨酸的单克隆抗体(4G10,Upstate)评价磷酸化FGFR3。用针对FGFR3的单克隆抗体(sc-13121,Santaxa0CruzBiotechnology)探测总FGFR3。使用下列的抗体探测FGFR3信号传导途径的磷酸化和激活:抗-FGFR^Y653/654,抗-FRS2α^Y196,抗-磷酸-p44/42MAPK^T202/Y204,抗-总p44/42MAPK和抗-AKT^S473获自Cellxa0SignalingTechnology(细胞信号传导技术)(Danvers,MA);和抗-总FRS2α(sc-8318)购自Santaxa0Cruzxa0Biotechnology(Santaxa0Cruz生物技术)(Santaxa0Cruz,CA)。印迹使用化学发光底物(ECLxa0Plus,Amershamxa0Pharmaciaxa0Biotech,Piscataway,NJ)显色。抗体表位作图为了确定R3Mab的表位,合成13种重叠肽(每种的长度为15个氨基酸)以覆盖人FGFR3从残基138至310的细胞外结构域。所述肽在C-端被生物素化,并且在链霉抗生物素蛋白板(Pierce,Rockford,IL)上俘获过夜。在用PBS/3%BSA封闭后,所述板与R3Mab温育,并使用HRP-缀合的抗-人IgG(Jacksonxa0Immunoresearch)和TMB过氧化物酶产色底物(KPL,Gaithersburg,MD)检测。小鼠抗人FGFR3杂交瘤抗体1G6,6G1,和15B2在ELISA测定中测试以鉴定它们的结合表位。1G6,6G1和15B2结合人FGFR3IgD2-IgD3(IIIb和IIIc同种型两者),而5B8仅结合人FGFR3-IIIb的IgD2-IgD3。在竞争测定中,1G6,6G1和15B2彼此竞争与人FGFR3的结合,表明1G6,6G1和15B2具有重叠的表位。没有一种杂交瘤抗体与噬菌体抗体184.6竞争,表明该杂交瘤抗体具有与184.6不同的一个或多个表位。小鼠抗-FGFR3抗体1G6,6G1,和15B2的制备和分子克隆将BALB/c小鼠用悬浮在单磷酰基脂质A/海藻糖dicrynomycolate(trehalosexa0dicrynomycolate)佐剂(Corixa,Hamilton,MT)中的2.0μgFGFR3-IIIb(rhFGFR3(IIIB)/Fc嵌合体(获自R&Dxa0Systems,catalog#1264-FR,lot#CYH025011),或用2.0μgxa0FGFR3-IIIc(rhFGFR3(IIIc)/Fc嵌合体(获自R&Dxa0Systems,catalog#766-FR,lot#CWZ055041)在每只后足垫中一周两次免疫12次。最后一次强化免疫后3天,将腘淋巴结与小鼠骨髓瘤细胞系P3X63Ag.U.1经电融合(Hybrimune,Cytoxa0Pulsexa0Sciences,GlenBurnie,Maryland)融合。使用在来自ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="277"/>杂交瘤选择试剂盒(StemCellxa0Technologies,Inc.,Vancouver,BC,Canada)的培养基D中的次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)选择从未融合的腘淋巴结或骨髓瘤细胞中选择融合的杂交瘤细胞。通过ELISA初步筛选培养上清液结合FGFR3-IIIb和FGFR3-IIIc的能力,随后通过FACS筛选目的杂交瘤对转染的FGFR3-IIIb的Ba/F细胞和对照Ba/F染色的能力,以及抗体阻断活性。然后将选择的杂交瘤通过有限稀释进行克隆。使用RNeasyxa0Mini试剂盒(Qiagen,德国)从产生小鼠抗人FGFRIII单克隆抗体1G6和15B2的杂交瘤细胞中提取总RNA。使用RT-PCR采用下列的简并引物扩增可变轻链(VL)和可变重链(VH)结构域:1G6:轻链(LC)正向:5’-GTCAGATATCGTKCTSACMCARTCTCCWGC-3’(SEQxa0IDxa0NO:195)重链(HC)正向:5’-GATCGACGTACGCTGAGATCCARYTGCARCARTCTGG-3’(SEQxa0IDxa0NO:196)6G1:轻链(LC)正向:5’-GTCAGATATCGTGCTGACMCARTCTCC-3’(SEQxa0IDxa0NO:197)重链(HC)正向:5’-GATCGACGTACGCTGAGATCCARYTGCARCARTCTGG-3’(SEQxa0IDxa0NO:198)15B2:轻链(LC)正向:5’-GTACGATATCCAGATGACMCARTCTCC-3’(SEQIDxa0NO:199)重链(HC)正向:5’-GATCGACGTACGCTGAGATCCARYTGCARCARTCTGG-3’(SEQxa0IDxa0NO:200)对于所有三种克隆的轻链和重链反向引物如下:轻链反向:5’-TTTDAKYTCCAGCTTGGTACC-3’(SEQxa0IDxa0NO:201)重链反向:5’-ACAGTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGMRGAGACDGTGASHRDRGT-3’(SEQxa0IDxa0NO:202)。正向引物对VL和VH区的N-端氨基酸序列特异。LC和HC反向引物设计用于分别与恒定轻链(CL)和恒定重链结构域1(CH1)中的区域退火,它们在物种间是高度保守的。将扩增的VL克隆至包含人κ恒定结构域的pRK哺乳动物细胞表达载体中(Shields等,(2000)J.Biol.Chem.(生物化学杂志)276:659)。将扩增的VH插入至编码全长人IgG1恒定结构域的pRK哺乳动物细胞表达载体中。使用常规方法确定重链和轻链的序列。结晶、结构测定和修正将人FGFR3-IIIbxa0ECD(残基143-374)克隆至pAcGP67A载体(BDBioscience,Sanxa0Jose,CA)中,在T.nixa0Pro细胞中生产并使用Ni-NTA柱然后用尺寸排阻层析纯化。R3Mabxa0Fab在大肠杆菌中表达并经蛋白G亲和柱、SP琼脂糖柱和Superdexxa075柱连续纯化。通过将Fab与过量的FGFR3ECD温育产生Fab-FGFR3复合体,然后该复合体脱糖基化并在20mMxa0TrisClpHxa07.5和200mMxa0NaCl缓冲液中经Superdex-200尺寸分离柱(sizingxa0column)纯化。汇集包含复合体的级分并浓缩至20mg/ml,并用于结晶试验中。结构测定中使用的晶体在4°C下使用蒸汽扩散法从下列条件中生长:0.1M二甲基砷酸钠pHxa06.5,40%MPD和5%PEG8000。数据使用HKL2000和Scalepack处理(56)。使用程序Phaser(57)和1RY3(FGFR3)和1N8Z(Fab片段)的坐标采用分子置换解析结构。使用程序Coot(58)完成建模,使用程序Refmac(59)将结构修正为20.4%/24.3%的R/R_free。坐标和结构因子以登录代码3GRW存放在蛋白数据库(Proteinxa0Dataxa0Bank)并且还公开在于2009年3月25日提交的USSNxa061/163,222中,两者的内容通过引用合并入本文中。ADCC测定人PBMC通过肝素化血液的蔗聚糖(Ficoll)梯度离心分离,并且使用作为靶标的多发性骨髓瘤细胞系OPM2或KMS11或膀胱癌细胞系RT112或UMUC-14和作为效应细胞的PBMC以1∶100的靶标∶效应子比率测量ADCC。靶细胞(10,000细胞/孔)用R3Mab或用对照人IgG1在37°C下处理4小时。通过使用CytoTox-ONE均质膜完整性测定(HomogeneousMembranexa0Integrityxa0Assay)根据生产商(Promega,Madison,WI)的说明书通过测量LDH释放来测定细胞毒性。结果使用下述公式表示为特定细胞裂解的百分比:细胞毒性(%)=[(实验性裂解-实验性自发裂解)/(靶标最大裂解-靶标自发裂解)]x100,其中自发裂解是在缺少抗体的条件下的非特异性细胞裂解,并且靶标最大裂解由1%Tritonxa0X-100诱发。结果FGFR3的可诱导shRNA敲低减少了体内膀胱癌生长作为评价FGFR3对体内肿瘤生长的重要性的开端,我们检验了体外FGFR3敲低的作用。在表达WT(RT112,RT4,SW780)或突变的(UMUC-14,S249C突变)FGFR3的膀胱癌细胞系中,几种FGFR3小干扰(si)RNA有效下调FGFR3。在所有四种细胞系中FGFR3敲低显著地抑制培养物的增殖(图15)。下一步,我们产生了表达强力霉素-可诱导性FGFR3shRNA的稳定的RT112细胞系。强力霉素对三种独立的FGFR3shRNA的诱导消除了FGFR3表达,而靶向EGFP的对照shRNA的诱导没有作用(图7A)。在缺少外源性FGF的条件下,强力霉素处理减少了表达不同FGFR3shRNA的细胞的[³H]-胸苷掺入,但对对照shRNA的细胞无作用(图7B),这证实FGFR3敲低抑制增殖。对数生长的RT112细胞的进一步分析表明用强力霉素处理72hr的FGFR3敲低显著地和特异性地减少了处于细胞周期的S和G2期的细胞的百分比,而伴有处于G1期的细胞增加(图7C)。使用两种其他FGFR3shRNA观察到相似的作用(图16A)。没有检测到显著数目的具有亚二倍体DNA含量的细胞,表明凋亡水平没有变化。因此,FGFR3敲低对RT112细胞的增殖的抑制作用主要归因于细胞周期进程的减缓。我们下一步评价了FGFR3敲低对在小鼠中预先建立的RT112肿瘤异种移植物的生长的作用。FGFR3敲低实质上和特异性地抑肿瘤生长(图7D,上部图片和图16B)。45天肿瘤样品的分析证实了与对照shRNA相比FGFR3shRNA的强力霉素诱导后的有效FGFR3敲低(图7D,底部图片)。这些结果证明FGFR3在体外和体内对于RT112膀胱癌细胞的生长均是至关重要的。阻断抗-FGFR3单克隆抗体的生成为了进一步检验FGFR3在肿瘤生长中的重要性并探究该受体作为治疗靶标的可能性,我们使用噬菌体展示方法开发了一种拮抗性抗-FGFR3单克隆抗体(称为R3Mab)。我们基于其阻断FGFR3的配体结合和二聚作用两者的能力,和其不仅抑制WTxa0FGFR3而且抑制该受体的最普遍的癌症相关突变体的特有能力选择了该特殊抗体(见下)。R3Mab靶向FGFR3的细胞外IgD2和IgD3结构域,它们对于FGF结合是必需的且是足够的(4)。R3Mab结合人FGFR3的IIIb和IIIc两种同种型,而没有显示与FGFR1,FGFR2或FGFR4的可检测到的结合(图8A)。Biacore分析表明R3Mab与鼠、食蟹猴和人FGFR3-IIIc具有类似的表观亲和力(未显示的数据)。R3Mab对人FGFR3的亲和力显示在表2中。表2.通过BIAcore分析测定的R3Mab对人FGFR3的亲和力。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>我们下一步测试了R3Mab阻断FGFR3与FGF1和FGF9结合的能力。R3Mab强力地抑制FGF1与FGFR3-IIIb和-IIIc的结合,其半最大抑制浓度(IC₅₀)分别为0.3nM和1.7nM(图8B,C)。同样,R3Mab有效阻断FGF9与FGFR3-IIIb和-IIIc的结合,其IC₅₀分别为1.1nM和1.3nM(图8D,E)。R3Mab抑制WTxa0FGFR3和其最普遍的癌症相关突变变体为了检验R3Mab是否抑制由WT或突变的FGFR3驱动的细胞增殖,我们利用了下面的观察结果,即鼠原-B细胞Ba/F3中的异位FGFR3表达赋予白介素(IL)-3-不依赖性的、FGF1依赖性的增殖和存活(29)。在缺少FGF1和IL-3的条件下,稳定表达WTxa0FGFR3的Ba/F3细胞不能成活,而FGF1极大地增强了它们的增殖(图9A)。R3Mab以剂量依赖性方式特异性地阻断FGF1-刺激的Ba/F3-FGFR3细胞增殖(图9A)。我们下一步评价了在这些细胞中R3Mab对FGFR3信号传导的影响。FGF1诱导FGFR3的磷酸化和激活,伴有p44/42MAPK的激活,而R3Mab有效地抑制两种分子的激活(图9B)。在膀胱癌中,FGFR3的体细胞激活突变集中在IgD2和IgD3之间的连接区、细胞外近膜结构域、或激酶结构域内(图9C)。细胞外错义置换最常见地导致未配对的半胱氨酸,导致FGFR3的配体不依赖性二聚作用。这些突变显著地导致不同水平的组成型FGFR3激活,可能归因于对细胞质激酶结构域的取向的差异性影响(30,31)。最频繁发生的突变是S249C,Y375C,R248C,G372C,和K652E,它们总共占膀胱癌中所有FGFR3突变的98%(32)。我们推断最适治疗剂应当不仅阻断WTxa0FGFR3蛋白(其在某些癌症中过表达),而且还阻断最多见的肿瘤相关的FGFR3突变体。为了进一步评价R3Mab,我们生成了稳定表达5种最常见FGFR3突变变体的每一种的Ba/F3细胞系。所有突变体在细胞表面以相似的水平表达,并且半胱氨酸突变体在没有配体的情况下自发地二聚化(未显示的数据)。表达不同半胱氨酸突变体的细胞系显示对FGF1的生长反应是可变的,这与早先的发现相符合(30,31)。如以前所报道的(33),表达FGFR3^R248C的细胞显示组成型的、配体不依赖性的增殖,并且对FGF1没有反应(图9D)。同样,最频繁发生的突变FGFR3^S249C,赋予配体不依赖性的增殖(图9E)。R3Mab显著地抑制由任一种突变体驱动的组成型增殖(图9D,E)。表达近膜结构域突变FGFR3^G372C(图9F)或FGFR3^Y375C(图9G)的细胞的增殖需要FGF1,并且它们的生长被R3Mab完全阻断。表达FGFR3^K652E的细胞显示弱的配体不依赖性增殖和响应于FGF1的明显生长(33)。R3Mab不影响FGFR3^K652E的弱基础活性(未显示的数据),但几乎消除了由该突变体介导的配体诱导的增殖(图9H)。因此,R3Mab具有抑制WTxa0FGFR3和FGFR3的常见的癌症相关突变体两者的独特能力。此外,R3Mab不显示可检测到的激动剂活性。作为单独的尝试,我们生成和表征了多种鼠-抗-人FGFR3杂交瘤抗体。没有一种杂交瘤抗体可以抑制我们测试的所有癌相关FGFR3突变体(图17),它们也不与R3Mab共享重叠表位。此外,所有杂交瘤抗体显示激动剂活性,强烈地刺激癌相关的FGFR3突变体R248C和S249C的增殖,并显示对突变体Y375C和G370C的增殖的一些刺激。这些杂交瘤抗体显示有差别水平的拮抗和激动作用,这取决于所测试的FGFR3突变体,如下所示:
xa0xa01G6
xa0xa06G1
xa0xa015B2
xa0xa0FGFR3-IIIb野生型
xa0xa0抑制
xa0xa0抑制
xa0xa0抑制
xa0xa0FGFR3-IIIbxa0R248C
xa0xa02X刺激
xa0xa04-5X刺激
xa0xa03-4X刺激
xa0xa0FGFR3-IIIbxa0S249C
xa0xa02X刺激
xa0xa04-5X刺激
xa0xa04-5X刺激
xa0xa0FGFR3-IIIbxa0Y375C
xa0xa01.2-1.5X刺激
xa0xa01.2-1.5X刺激
xa0xa01.2-1.5X刺激
xa0xa0FGFR3-IIIbxa0K652E
xa0xa050%抑制
xa0xa060-70%抑制
xa0xa0抑制
xa0xa0FGFR3-IIIc
xa0xa0抑制
xa0xa0抑制
xa0xa0抑制
xa0xa0FGFR3-IIIcxa0G370C
xa0xa0无作用
xa0xa020-30%抑制
xa0xa010-2-%抑制
因此,所述杂交瘤抗体显示了对由不同FGFR3变体驱动的Ba/F3细胞细胞增殖的不可预测的差别作用。小鼠-抗-人FGFR3杂交瘤抗体的表征小鼠抗-人FGFR3杂交瘤抗体进一步表征如下:(1)在测试抗-FGFR3鼠杂交瘤抗体抑制FGF1与人FGFR3-IIIb和IIIc同种型结合的能力的测定中,抗体1G6,6G1和15B2能够以剂量依赖性方式阻断FGF1与人FGFR3-IIIb和IIIc同种型的结合。当在约2000至0.49ng/ml的抗体浓度范围内测试时,抗体1G6,6G1和15B2以0.69,0.87和0.72nM的IC50值阻断FGF1与FGFR3-IIIb的结合。当在约5000至1.2ng/ml的抗体浓度范围内测试时,抗体1G6,6G1和15B2分别以0.57,3.4和0.7nM的IC50值阻断FGF1与FGFR3-IIIc的结合。(2)在测试抗-FGFR3鼠杂交瘤抗体抑制FGF9与人FGFR3-IIIb和IIIc同种型结合的能力的测定中,抗体1G6,6G1和15B2以剂量依赖性方式有效地阻断FGF1与人FGFR3-IIIb和IIIc同种型的结合。当在约2000至0.49ng/ml的抗体浓度范围内测试时,抗体1G6,6G1和15B2分别以0.13,0.16,和0.07nM的IC50值阻断FGF9与FGFR3-IIIb的结合。当在约5000至1.2ng/ml的抗体浓度范围内测试时,抗体1G6,6G1和15B2分别以0.13,0.11,和0.07nM的IC50值阻断FGF9与FGFR3-IIIc的结合。(3)使用Biacore分析测定全长抗-FGFR3鼠杂交瘤抗体1G6,6G1和15B2的结合亲和力。这一分析的结果显示在表3中。表3.ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>(4)在测试抗-FGFR3鼠杂交瘤抗体抑制由人FGFR3-IIIb或IIIc驱动的Ba/F3细胞增殖的能力的测定中,抗体1G6,6G1和15B2能够以剂量依赖性方式阻断由人FGFR3-IIIb或IIIc驱动的Ba/F3细胞增殖。当在约0.01至100ug/ml的抗体浓度范围内测试时,抗体1G6,6G1和15B2分别以3-5nM,3nM,和6-8nM的IC50值阻断由FGFR3-IIIb驱动的Ba/F3细胞增殖,并且分别以10-35nM,24nM,和60nM的IC50值阻断由FGFR3-IIIc驱动的Ba/F3细胞增殖。(5)在测试抗-FGFR3鼠杂交瘤抗体抑制表达人FGFR3-IIIb的Ba/F3细胞中的FGF1-诱导的信号传导的能力的测定中,当在约0.25至6.75ug/ml的抗体浓度范围内测试时,抗体1G6,6G1和15B2能够以剂量依赖性方式阻断表达人FGFR3-IIIb的Ba/F3细胞中的FGF1-诱导的信号传导。在该实验中使用25ng/ml的FGF1。在缺少FGF1的条件下,抗体处理对FGFR3激活没有作用。(6)在测试抗-FGFR3鼠杂交瘤抗体抑制表达人FGFR3-IIIc的Ba/F3细胞中的FGF1-诱导的信号传导的能力的测定中,当在约0.25至6.75ug/ml的抗体浓度范围内测试时,抗体1G6,6G1和15B2能够以剂量依赖性方式阻断表达人FGFR3-IIIc的Ba/F3细胞中的FGF1-诱导的信号传导。在该实验中使用25ng/ml的FGF1。在缺少FGF1的条件下,抗体处理对FGFR3激活没有作用。R3Mab与FGFR3相互作用的结构基础为了了解R3Mab与FGFR3相互作用的模式,我们合成了一组跨越FGFR3-IIIbxa0IgD2和D3区的13个重叠肽,并测试了它们与R3Mab的结合。肽3(残基164-178)和11(残基269-283)显示与R3Mab的特异性结合,其中肽3具有较强的相互作用(图10A),这表明FGFR3上的相应区对于R3Mab的识别是至关重要的。以前对与FGF2形成复合体的FGFR1的结晶学研究鉴定了参与与FGF和肝素直接结合以及受体二聚作用的关键性受体残基(34)。FGFR3肽3和11与FGFR1中功能上重要的位点的比对揭示了这些肽涵盖对于直接FGF2结合、受体二聚作用以及与肝素的相互作用至关重要的相应FGFR1残基(图10B)。这些数据表明在FGFR3上R3Mab的表位与参与配体缔合和受体-受体相互作用的受体残基重叠。我们下一步结晶了R3Mab的Fab片段和人FGFR3-IIIb的细胞外IgD2-D3区之间的复合体,并以ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="133"/>解析度测定了X-线结构(图10C,D;表4)。在该复合体中,约ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="204"/>和ntent="drawing" img-format="tif" inline="yes" orientation="portrait" wi="216"/>的溶剂可及表面积分别包埋在FGFR3和Fab中。约80%被包埋的界面涉及IgD2,而其余的限定在接头和IgD3区。在复合体的Fab侧,约40%被包埋的界面涉及互补决定区(CDR)-H3,20%涉及CDR-H2,20%涉及CDR-L2,较少的贡献来自其他CDRs和构架残基。值得注意的是,来自CDR-H3的氨基酸(AAs)形成两个β-链,其延长了IgD2的β-折叠(图10D)。Fab与构成FGFR3的FGF结合位点的AAs和形成受体二聚化界面的残基相互作用,如以前在多种二聚体FGF:FGFR复合体(例如,PDB代码1CVS,(34);和图10C,灰色/阴影交叉线和深灰色的区域)中所鉴定的那样。通过结晶学鉴定的相互作用界面与基于肽的数据完全一致(图18A,B)。总之,这些结果揭示了R3Mab如何抑制配体结合,并且进一步表明R3Mab与FGFR3的结合可能防止受体二聚化。接触R3Mab的FGFR3氨基酸显示在表5中。对该结构的结晶学坐标以登录代码3GRW保存在蛋白质数据库(Proteinxa0Dataxa0Bank)中。表4:结晶学分析的概述ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="401"/>^aR_sym=∑|I-<I>|/∑I。<I>是独特反射的对称相关观测的平均强度。^b括号中的数字是指最高的解析度对象(resolutionxa0shell)。^cR=∑|F_o-F_c|/∑F_o。R_free作为R计算,但用于从所有修正中剔除的5%的反射。表5:FGFR3中与R3Mab接触的残基残基xa0xa0界面中残基的被包埋的表面xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0THRxa0154xa00.10ARGxa0155xa016.50ARGxa0158xa0105.40METxa0159xa06.00LYSxa0161xa052.50LYSxa0162xa01.70LEUxa0163xa012.30LEUxa0164xa055.10ALAxa0165xa010.10VALxa0166xa010.60PROxa0167xa045.50ALAxa0168xa022.60ALAxa0169xa063.60ASNxa0170xa075.40THRxa0171xa083.00VALxa0172xa01.70ARGxa0173xa091.70PHExa0174xa01.50ARGxa0175xa095.60PROxa0177xa015.90GLYxa0202xa02.10LYSxa0205xa063.40ARGxa0207xa067.60GLNxa0210xa031.60SERxa0212xa00.40VALxa0214xa026.40GLUxa0216xa048.90SERxa0217xa01.80TYRxa0241xa015.90LEUxa0246xa03.10GLUxa0247xa01.80ARGxa0248xa046.90TYRxa0278xa032.20SERxa0279xa01.80ASPxa0280xa019.80ALAxa0281xa03.00GLNxa0282xa024.80PROxa0283xa00.50SERxa0314xa01.20GLUxa0315xa082.60SERxa0316xa033.20VALxa0317xa056.60GLUxa0318xa051.50我们将R3Mab-FGFR3结构与以前发表的与FGF1形成复合体的FGFR3-IIIc的结构(4,35)进行了比较(图10E,10F)。抗体-受体和配体-受体复合体的重叠揭示了除了区分FGFR3-IIIc与FGFR3-IIIb的区域以外,在各个受体结构域内没有显著的构象差异;然而,IgD3相对于IgD2的定向极大地不同(图10E,白色和灰色;图10F,白色和灰色的网)。由于IgD2和IgD3的相对位置对于配体结合是至关重要的,因此在R3Mab结合时IgD3所采取的交替构象可能提供防止配体与FGFR3相互作用的另外的机制。R3Mab抑制膀胱癌细胞中的内源性WT和突变的FGFR3为了评价R3Mab是否能够抑制膀胱癌细胞中的FGFR3功能,我们首先检验了RT112和RT4细胞系,它们表达WTxa0FGFR3。R3Mab强力地抑制RT112细胞的[³H]-胸苷掺入(图11A)并且发挥明显的但较为适度的对RT4细胞增殖的抑制(图19A)。为了研究R3Mab对FGFR3激活的作用,我们检验了RT112细胞中FGFR3的磷酸化。与Ba/F3-FGFR3细胞中的结果(图9B)一致,R3Mab显著地减少了FGF1-诱导的FGFR3磷酸化(图11B)。我们下一步检验了FRS2α,AKT,和p44/42MAPK的磷酸化,它们三个是FGFR3信号传导的下游介质。在RT112细胞中FGF1强力地激活这些分子,而R3Mab显著地消除这种激活(图11B)。同样,在RT4细胞中R3Mab抑制FGF1-诱导的FGFR3和MAPK的磷酸化(图19B)。我们下一步研究了R3Mab是否能够在人膀胱癌细胞中抑制内源性突变的FGFR3的激活。在膀胱癌中S249C是最常见的FGFR3突变(图9C)。两种可获得的细胞系UMUC-14和TCC-97-7携带突变的FGFR3^S249C等位基因(参考文献36和未显示的数据)。尽管R3Mab不影响培养的UMUC-14细胞的对数生长(未显示的数据),但其明显地减少了这些细胞的克隆生长(图11C)。具体地,与对照抗体相比,R3Mab减少了直径大于120μm的集落数目大约77%(图11D)。此外,R3Mab抑制培养的TCC-97-7细胞的[³H]-胸苷掺入(图19C)。据报道S249C突变导致FGFR3的配体不依赖性激活(26,30)。实际上,在UMUC-14细胞和TCC-97-7细胞中,FGFR3^S249C被组成型地磷酸化,无论是否用FGF1处理,而在两种细胞系中与对照抗体相比,R3Mab减少了FGFR3^S249C的组成型磷酸化(图11E,19D)。R3Ma抑制FGFR3^S249C的二聚体形成考虑到突变体FGFR3^S249C可能经历二硫化物连接的配体不依赖性二聚作用,R3Mab抑制膀胱癌细胞中组成型FGFR3^S249C信号传导和增殖的能力是令人惊奇的(26,30)。为了探寻R3Mab如何抑制FGFR3^S249C,我们在UMUC-14细胞中检验了R3Mab对该突变体的低聚体状态的作用。在还原条件下,FGFR3^S249C作为~97kDa的单一条带迁移,与单体大小一致(图12A)。在非还原条件下,在用对照抗体处理的细胞中,一个大的FGFR3^S249C级分作为~200kDa的条带出现,无论是否添加FGF1,这表示组成型的二聚体状态(图12A)。R3Mab处理实质上地减少了二聚体的量,伴有单体的增加(图12A)。与此相一致地,在TCC-97-7细胞中R3Mab减少了FGFR3^S249C二聚体的水平,无论是否用FGF1处理(图19E)。在膀胱癌细胞中R3Mab如何减少FGFR3^S249C二聚体水平?一种可能的解释是其通过抗体诱导的FGFR3内在化和通过内体或溶酶体运输而破坏了FGFR3^S249C二聚体。我们通过药理学干预胞吞作用来测试了这种可能性。但R3Mab在用多种胞吞作用抑制剂预处理的UMUC-14细胞中仍然降低了二聚体的量,尽管基本上阻断了FGFR3^S249C内在化(图20A,B)。因此,R3Mab的二聚体破坏不依赖于胞吞作用。另一种可能的解释是细胞的FGFR3^S249C可能以动态的单体-二聚体平衡存在;因此,R3Mab与单体FGFR3^S249C的结合可能阻止了二聚体形成并且因此使该平衡朝向单体状态改变。为了检验这种可能性,我们使用了非细胞通透剂5,5’二硫代双2-硝基苯甲酸(DTNB),其选择性地与未配对的半胱氨酸的游离巯基反应并阻断该游离的巯基(37)。用DTNB处理UMUC-14细胞导致FGFR3^S249C单体的积聚而二聚体减少(图12B),表明FGFR3^S249C以单体和二聚体之间的动态平衡存在。为了测试R3Mab是否影响该平衡,我们生成了一种包含FGFR3^S249C的IgD2-D3结构域的可溶性重组蛋白,并且通过尺寸排阻层析分离了该二聚体。我们将该二聚体与缓冲液或抗体在存在非常低浓度的还原剂(25μMofxa0DTT)的条件下温育,并通过SDS-PAGE在非还原条件下分析该受体的低聚体状态。与模拟(mock)或抗体对照相比,R3Mab显著地加速了代表单体FGFR3^S249C的~25kDa条带的出现,同时减少了~50kDa二聚体(图12C);实际上,在R3Mab的存在下,到2hr时基本上更完全地减少了二聚体。这些结果表明R3Mab以利于单体的方向改变了FGFR3^S249C的单体和二聚体状态之间的平衡。R3Mab不促进FGFR3下调我们通过分析FGFR3抗体处理的细胞中FGFR3内在化和降解来检验R3Mab(克隆184.6.1)和抗-FGFR3杂交瘤抗体对FGFR3下调的作用。将表达野生型FGFR3(RT112)或突变的FGFR3(TCC97-7中的S249C)的膀胱癌细胞系用R3Mab或杂交瘤抗体1G6或6G1处理4至24小时,然后收获细胞裂解物用于总FGFR3水平的western印迹分析。用R3Mab处理不减少FGFR3水平,而用杂交瘤mabsxa01G6和6G1处理显著地降低FGFR3水平。这些结果提示R3Mab不促进FGFR3下调而mabsxa01G6和6G1的确促进FGFR3受体内在化和下调。在单独的实验中,使用FACS分析检验表面FGFR3水平。R3Mab(克隆184.6.1)处理UMUC-14细胞(包含FGFR3S249C突变)24小时后,细胞表面FGFR3水平轻微升高。这些结果证明R3Mab处理不促进FGFR3下调。在多个肿瘤模型中R3Mab抑制生长和FGFR3信号传导下一步,我们检验了R3Mab在体内对膀胱癌细胞的生长的作用。我们用RT112细胞(其表达WTxa0FGFR3)注射nu/nu小鼠,使肿瘤生长至~150mm³的平均体积,并对动物给予赋形剂或R3Mab一周两次。在27天时与赋形剂对照相比,以5或50mg/kg的R3Mab处理分别抑制肿瘤生长约41%或73%(图13A)。处理后48hr或72hr采集的肿瘤裂解物的分析显示R3Mab显著降低磷酸化FRS2α的水平(图13B)。有趣的是,在R3Mab-处理的肿瘤中,总FRS2α蛋白水平也较低,提示抑制FGFR3可以进一步导致FRS2α的下调。R3Mab还降低肿瘤中磷酸化MAPK的量,而不影响总MAPK水平(图13B)。因此,R3Mab抑制RT112肿瘤异种移植物的生长并阻断由WTxa0FGFR3引起的信号传导。我们下一步研究了R3Mab对表达突变FGFR3的异种移植物的生长的作用。R3Mab处理极大地延缓了Ba/F3-FGFR3^S249C肿瘤的进展(图13C)。此外,R3Mab显著地抑制UMUC-14膀胱癌异种移植物的生长(图13D)。为了评价R3Mab是否在体内影响FGFR3^S249C激活,我们评估了处理后24hr或72hr采集的肿瘤裂解物中的FGFR3^S249C二聚体水平。在非还原条件下,与对照组相比,在R3Mab处理的肿瘤中FGFR3^S249C二聚体的量大量降低,而通过在还原条件下检测到的量判断,总FGFR3^S249C水平显示很小的变化(图13E)。与细胞培养中的结果相反,在肿瘤裂解物中没有观察到明显的FGFR3^S249C单体的积聚(图13Exa0vs.12A)。这可能是因为在非还原条件下本研究中使用的兔多克隆抗-FGFR3抗体对单体FGFR3的检测灵敏度较弱的缘故(图21)。重要的是,R3Mab还显著地抑制UMUC-14肿瘤中MAPK的磷酸化和激活(图13E),提示R3Mab在体内抑制FGFR3^S249C的活性。在任一项体内研究中我们均没有观察到显著的体重减轻或其他显著的异常。此外,在小鼠中进行的安全性研究中,与人和鼠FGFR3两者以类似的亲和性结合的R3Mab在任何器官(包括膀胱)中均没有显示任何可分辨的毒性(未显示的数据)。总之,这些数据表明在小鼠中可良好地耐受对R3Mab的多次暴露。R3Mab在多发性骨髓瘤异种移植物模型中的抗肿瘤活性涉及ADCC为了评估R3Mab是否可能具有对多发性骨髓瘤的治疗潜力,我们首先测试了R3Mab对三种培养的t(4;14)+细胞系的增殖和存活的作用。UTMC-2细胞携带WTxa0FGFR3,而OPM2和KMS11分别带有K650E和Y373C置换(7)。在培养中,R3Mab完全消除了FGF9-诱导的UTMC-2细胞的增殖(图22A)。R3Mab适度地抑制了OPM2细胞的生长,但对KMS11细胞的增殖没有明显作用(图22B,C)。由于UTMC-2细胞在小鼠中不形成肿瘤,我们评价了R3Mab针对OPM2和KMS11肿瘤的功效。R3Mab几乎完成消除了两种细胞系的异种移植物肿瘤生长(图14A,B)。R3Mab在体外和体内针对OPM2和KMS11肿瘤细胞的活性的显著差异提示R3Mab可能能够支持Fc-介导的针对这些过表达FGFR3的肿瘤的免疫效应子功能的可能性。两种细胞系均表达高水平的CD55和CD59(未显示的数据),它们是补体途径的两种抑制剂;因此,没有观察到补体依赖的细胞毒性(未显示的数据)。然后,我们集中于ADCC。当抗体在靶细胞上与其抗原结合时发生ADCC,并且经由其Fc区,连接免疫效应细胞上表达的Fcγ受体(FcγRs)(38)。为了在体外测试ADCC,我们将KMS11或OPM2细胞与刚分离的人外周血单核细胞(PBMC)在存在R3Mab或对照抗体的条件下温育。R3Mab介导针对两种骨髓瘤细胞系的显著的PBMC细胞裂解活性(图14C,D)。相反,R3Mab不支持膀胱癌RT112或UMUC-14细胞的细胞裂解(图14E,F)。当通过Scatchard分析测量时,多发性骨髓瘤细胞比膀胱癌细胞系表达实质上更多的细胞表面FGFR3(~5-6倍多的受体/细胞;图23A,B)。为了了解ADCC对R3Mab的体内活性的贡献,我们将以前表征的D265A/N297A(DANA)突变引入至抗体的Fc结构域中。抗体的Fc结构域中的这种双重置换消除了其与FcγRs的结合(39),阻止了对免疫效应细胞的募集。DANA突变不改变R3Mab与FGFR3的结合或在体外对FGFR3活性的抑制,也不改变小鼠中R3Mab的药代动力学(未显示的数据);然而,其基本上消除了针对OPM2或KMS11异种移植物的体内活性(图14G,H)。相反,DANA突变不改变R3Mab针对RT112和UMUC-14膀胱癌异种移植物的抗-肿瘤活性(图24A,B)。总之,这些结果提示Fc-依赖性的ADCC在R3Mab针对OPM2和KMS11多发性骨髓瘤异种移植物的功效中具有重要的作用。其他异种移植物研究R3Mab(克隆184.6.1N54S)进一步如下表征:(a)基本上如上所述,使用基于肝癌细胞系(Huh7)的肿瘤异种移植物模型测试R3Mab的体内功效。当以5mg/kg和30mg/kg的抗体浓度测试时,R3Mab在体内显著抑制肿瘤生长。与对照动物中的肿瘤生长相比,肿瘤生长被抑制约50%。(b)基本上如上所述,使用基于乳腺癌细胞系(Cal-51)(其表达FGFR3)的肿瘤异种移植物模型测试R3Mab的体内功效。来自该功效研究的结果表明当以约1mg/kg至100mg/kg范围内的抗体浓度测试时,R3Mab能够在体内抑制肿瘤。与对照动物中的肿瘤生长相比,肿瘤生长被抑制约30%。讨论在t(4;14)+多发性骨髓瘤患者中FGFR3过表达与预后差的关联性和在几个实验模型中激活的FGFR3的转化活性已经将FGFR3确定为这种血液恶性肿瘤中的一个重要致癌驱动物且因此是潜在的治疗靶标。相反,尽管在膀胱癌中报道有高频率的FGFR3突变和/或过表达(24,25,40),但在体内还没有确定FGFR3信号传导在这种上皮恶性肿瘤中的关键作用。此外,抑制FGFR3在膀胱癌中的治疗潜力还有待确定。在此我们显示遗传或药理学干预FGFR3抑制小鼠中几种人膀胱癌异种移植物的生长。这些结果证明FGFR3功能在这种背景中对于肿瘤生长是至关重要的,强调了该受体作为膀胱癌中的致癌驱动物和治疗靶标的潜在重要性。FGFR3功能的阻断以类似的方式抑制表达WT或突变FGFR3的异种移植物的生长,提示该受体的两种形式可以显著地促进膀胱肿瘤的进展。虽然不及在膀胱癌中频繁,但FGFR3突变或过表达在其他实体恶性肿瘤中也已经被鉴定到,包括子宫颈癌(40),肝细胞癌(41)和非小细胞肺癌(42,43),提示了FGFR3对其他类型上皮癌的潜在贡献。FGFR3在各种恶性肿瘤中的明显参与使该受体被鉴定为靶向治疗的一个吸引人的候选物。尽管已经记载了可以抑制FGFR3激酶活性的小分子化合物(18-22,44),但FGFR家族内激酶结构域的密切同源性已经妨碍了FGFR3-选择性抑制剂的开发。已报道的抑制剂缺少选择性使得难以辨别FGFR3对特定癌症类型的生物学的相对贡献度;此外,其可能带有安全性责任,有最大剂量水平的限制,并且因此限制了对FGFR3的最适抑制。因此,为了实现对FGFR3的选择性和特异性靶向,我们转向了基于抗体的策略。我们的理由是最适的治疗性抗体应当能够不仅阻断WT而且能够阻断FGFR3的常见癌症相关突变体。此外,已知FGFR3的二聚作用对于其激活是至关重要的,不仅阻断配体结合而且干预受体二聚作用的抗体可能是较佳的。其他所需的性质将包括支持Fc介导的效应子功能的能力和全长抗体的天然构架所赋予的长血清半衰期。我们将我们的筛选和改造工作集中于鉴定结合了所有这些特征的抗体分子,从而产生了R3Mab。结合研究证明R3Mab与FGF配体竞争与FGFR3的IIIb和IIIc同种型两者的相互作用的能力。使用转染的BaF/3细胞系的更多实验证实了R3Mab阻断WT和常见的癌症相关FGFR3突变体的卓越能力。另外,R3Mab在表达WTxa0FGFR3或FGFR3^S249C(其是这种疾病中该受体的最常见突变体)的膀胱癌的几种异种移植物模型中发挥了明显的抗-肿瘤活性。药效学研究提示R3Mab在这些模型中的抗肿瘤活性基于对FGFR3信号传导的抑制,这显然是通过消除其下游调控剂FRS2α和MAPK的磷酸化。这些数据进一步强化了这样的结论,即FGFR3是膀胱肿瘤进展所必需的,如通过我们的FGFR3shRNA研究所证明的那样。膀胱癌中的FGFR3突变代表了实体恶性肿瘤中蛋白激酶最频繁发生的致癌变化之一,使人想起了黑色素瘤中B-Raf的常见突变(45)。FGFR3中的大多数激活的突变产生未配对的半胱氨酸,导致配体不依赖性的受体二聚作用,并且导致各种程度的组成型激活。以前使用单价抗-FGFR3Fab片段的研究表明针对特定FGFR3突变体的差别性抑制活性(46);然而,并没有研究这种可变作用的分子基础。与单价抗体片段相比,二价抗体具有诱导抗原聚集的能力,并且在受体酪氨酸激酶的情况下,可以导致受体低聚化和激活。尽管其全长的二价构象,R3Mab显示对WTxa0FGFR3和广谱FGFR3突变体的普遍抑制,包括这样的变体,它们是配体依赖的(FGFR3^G372C,FGFR3^Y375C),组成型活性的(FGFR3^R248C,FGFR3^S249C),或具有两种性质(FGFR3^K652E)。这些结果提出了这样的问题:R3Mab如何对抗WT和各种FGFR3突变体(包括二硫化物连接的变体)?基于与FGFR1的序列比对,被R3Mab识别的肽表位与参与结合配体和肝素以及受体二聚作用的FGFR3残基重叠。该结论通过R3Mab与FGFR3的细胞外区之间的复合体的结晶学研究的证实。X-线结构揭示所述抗体结合IgD2和IgD3的区域,所述区域对于配体-受体相互作用以及受体-受体接触是至关重要的。因此,R3Mab可以通过竞争配体结合并通过阻止受体二聚作用来阻断WTxa0FGFR3。R3Mab可以采用类似的机制来抑制FGFR3^K652E,后者具有低组成型活性,但需要配体用于完全激活。此外,R3Mab的结合改变了FGFR3IgD3相对于IgD2的相对方向。这个发现提出了这样一种形式上的可能性,即该抗体也可以通过强迫形成不导致信号转导的构象(这种想法需要进一步研究)来抑制受体激活。为了更好地了解R3Mab如何阻断具有未配对的半胱氨酸的FGFR3变体,我们更详细地分析了最常见的突变体FGFR3^S249C。使用游离巯基阻断剂DTNB的实验表明FGFR3^S249C的单体和二聚体状态之间的动态平衡。对于NMDA受体已经报道了通过内源性氧化还原调节剂调控氧化和还原状态之间的类似平衡(46)。将表达FGFR3^S249C的膀胱癌细胞与R3Mab温育导致受体二聚体量的减少并伴有单体水平的增加。此外,纯化的FGFR3^S249C的IgD2-D3片段在溶液中形成二聚体;当与R3Mab温育时,二聚体不断地消失,而单体FGFR3^S249C积聚。综合结构分析,这些结果提示R3Mab俘获单体FGFR3^S249C并阻碍其二聚化。随着时间推移,R3Mab使平衡朝向单体状态迁移,阻断组成型受体活性。这一机制也可以解释R3Mab如何抑制FGFR3的其他半胱氨酸突变体。该研究的另一重要发现是在体内R3Mab针对t(4;14)+多发性骨髓瘤细胞系OPM2和KMS11的有效抗肿瘤活性。相反,R3Mab对培养中的这些细胞的增殖或存活具有中度至最小的影响。OPM2和KMS11细胞表达相对高水平的细胞表面FGFR3(比RT112和UMUC-14膀胱癌细胞高4-5倍)。这些较高的抗原密度可以允许R3Mab支持有效募集携带FcγR的免疫效应细胞并激活ADCC。实际上,在人PBMC的存在下,R3Mab介导OPM2和KMS11细胞的细胞裂解,但不介导RT112或UMUC-14膀胱癌细胞的细胞裂解。此外,R3Mab的DANA突变形式不能够结合FcγR,其在体内对KMS11或OPM2的生长没有作用,但仍然与R3Mab相似地抑制RT112和UMUC-14肿瘤的生长。总之,这些数据表明R3Mab具有抗肿瘤活性的双重机制:(a)在表达较低表面水平的WT或突变FGFR3的细胞中,其阻断配体依赖性或组成型信号传导;(b)在表达相对高的表面FGFR3水平的细胞中,其诱导ADCC。我们的结果还提出了一些新的问题。首先,还不知道在此研究中测试的膀胱癌细胞系为什么显示对R3Mab的可变敏感性。这种差别性的反应对于靶向治疗是普遍的,其可能反映了每种肿瘤的显著不同的基因组成。实际上,Her2-阳性乳腺癌细胞显示对抗-Her2抗体的可变敏感性(48),正如多种癌细胞对抗-EGFR抗体的反应那样(49)。在这种情形下,急切需要开发另外的具有WT和突变FGFR3的膀胱癌的体内模型以在动物中评估对FGFR3分子的敏感性。此外,对预测性生物标志物的阐明可以有助于识别可能从FGFR3靶向治疗中最适宜受益的患者。其次,因为在我们检验的模型中R3Mab不诱导肿瘤消退,因此未来的研究应该探寻R3Mab是否可以与已确定的治疗剂协同作用。总之,我们的发现暗示WT和突变FGFR3两者对于膀胱癌生长是重要的,因此将该受体的体内致癌参与作用从血液恶性肿瘤扩展至上皮恶性肿瘤。此外,我们的结果证明可以使用全长抗体在肿瘤中有效地靶向WT和突变FGFR3两者,所述全长抗体综合了阻断配体结合、受体二聚作用和信号传导以及促进通过ADCC裂解肿瘤细胞的能力。这些结果为在与FGFR3相关的多种多样的恶性肿瘤中研究基于抗体的靶向FGFR3的治疗提供了强有力的基本原理。部分参考文献列表1.Eswarakumar,V.P.,Lax,I.,和Schlessinger,J.2005.Cellularsignalingxa0byxa0fibroblastxa0growthxa0factorxa0receptors(成纤维细胞生长因子受体的细胞信号传导).Cytokinexa0Growthxa0Factorxa0Rev(细胞因子和生长因子综述)16:139-149.2.L′Hote,C.G.,和Knowles,M.A.2005.Cellxa0responsesxa0toxa0FGFR3signalling:growth,differentiationxa0andxa0apoptosis(细胞对FGFR3信号传导的反应:生长、分化和凋亡).Expxa0Cellxa0Res(实验细胞学研究)304:417-431.3.Dailey,L.,Ambrosetti,D.,Mansukhani,A.,和Basilico,C.2005.Mechanismsxa0underlyingxa0differentialxa0responsesxa0toxa0FGFxa0signaling(对FGF信号传导的差别性反应的基本机制).Cytokinexa0Growthxa0Factorxa0Rev(细胞因子和生长因子综述)16:233-247.4.Mohammadi,M.,Olsen,S.K.,和Ibrahimi,O.A.2005.Structuralbas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